Дипломная (вкр): Оценка метанолутилизирующей активности биопрепарата экологического назначения для очистки окружающей среды от метанола

Приготовленную в колбе рабочую культуру разливают по 5,0 см во флаконы емкостью 10,0 см, которые пробкуют, замораживают и хранят в течение одного года при температуре минус 18-22 °С.

2.4.   Материалы, растворы, реактивы

Биопрепарата БИОМ-М, серия 180516, дата производства 18.05.2016, срок годности 18.05.2018.

Глауконит поступал из Каринского месторождения Челябинской области.

Использовали сырье, реактивы и материалы, прошедшие входной контроль и отвечающие требованиям действующих нормативных документов.

2.5.   Технологическое оборудование

Культивирование штаммов проводили во флаконах (объемом 0,1 дм3) на качалках NewBrunswick (США, модель G-53), в ферментерах марки «БИОР-0,25».

Оптическую плотность нативных культур определяли с помощью колориметра фотоэлектрического концентрационного КФК-2МП, а рН - иономером типа ЭВ-74.

Просеивание глауконита осуществляли на вибросите ВС-100, с диаметром отверстий сетки 1 мм.

Прокаливание глауконита осуществляли в сухожаровом шкафу ШСС-250, при температуре 200±15°С.

Для иммобилизации смеси культур на природном ионообменнике - глауконите применяли установку гранулирования и сушки типа 524Р-АК.

Смешение с аэросилом для получения сухой порошковой формы БИОМ-М проводили в барабанном смесителе с 1-2 кг стальных шаров диаметром от 6 до14 мм.

Порошок рассыпали по 1000±10 мг в двойные пакетики из ламинированной бумаги на автомате типа АР - И 3.

2.6.   Методы исследований

РН сред и растворов определяли потенциометрическим методом.

Общую концентрацию микроорганизмов (ОК) определяли методом последовательных десятикратных разведений испытуемого микробного материала в 0,85%-ном растворе хлористого натрия с последующим подсчетом бацилл в камере Горяева.

Концентрацию живых микроорганизмов (БК) определяли методом последовательных десятикратных разведений испытуемого микробного материала в 0,85%-ном растворе хлористого натрия с последующим его высевом на МПА в чашки Петри. После (24+4) ч инкубации при температуре (37+1)0С проводили подсчет выросших колоний. Учету подлежали чашки, на которых выросло от 150 до 300 колоний. БК в сухой культуре определяли после их регидратации.

Биологическую концентрацию термоустойчивых клеток (БКt) определяли методом последовательных десятикратных разведений испытуемой микробной суспензии в 0,85 %-ном растворе хлористого натрия с последующим нагреванием до (94,0+0,5)0С в течение (13+1) минут и высевом микробной суспензии на МПА. После (24+4) ч инкубации при температуре (37+1)0С проводили подсчет выросших колоний.

Влажность препарата «БИОМ-М» определяли по разности массы проб до и после высушивания при температуре (105±2)°С.

Величину относительной гигроскопичности порошка определяли по формуле:

                                                                                             (1)

где К - относительная гигроскопичностъ, ед;- влагосодержание в исследуемом материале при соответствующей влажности воздуха, кг/кг (по абсолютно сухому веществу);э - влагосодержание эталона при соответствующей влажности воздуха, кг/кг.

За эталон была принята фильтровальная бумага, удельная влагоемкость которой считается величиной постоянной во всем диапазоне относительной влажности окружающей среды и равной 0,01 Umax (Umax ~ максимальное сорбционное влагосодержание эталона при температуре 25°С).

Коэффициент неоднородности смеси массы рассчитывали по формуле:

                                                                                (2)

где Rc - коэффициент неоднородности смеси, %;- истинная концентрация одного из компонентов, %;

С - средняя концентрация того же компонента, %;число проб;

∑ - сумма.

Для определения сыпучести порошков пробу весом (50+0,5) г засыпали в воронку. С открытием конуса и началом высыпания порошка регистрировали время истечения всей навески. Расчет проводили по формуле:

                                                                                              (3)

где V - сыпучесть порошка, г/мин;- навеска порошка, г;

τS - время истечения всей навески порошка через воронку, мин.

Определение адсорбционной активности по ГОСТ 4453-74.

Для определения сроков годности и условий хранения «БИОМ-М» использовали метод «ускоренного старения» в соответствии с «Временной инструкцией по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода «ускоренного старения» при повышенной температуре. И-42-2-82. Министерство здравоохранения СССР. Министерство медицинской промышленности. 1983 г.» и «Методами контроля бактериологических питательных сред. Методические указания. Мук 4.2.2316-08 (утв. Роспотребнадзором 18.01.2008)».

Отбор проб производился в соответствии с инструкцией. Почва: точечные пробы отбирали в квадратах 1х1 м, расположенных по периметру и в центре площадки, с помощью пробоотборника. Глубина отбора, 0-20 см. Вода: точечные пробы отбирали из озера на различной глубине, из полученного количества составляли усреднённую пробу объёмом 1,5 л.

Контроль метанолутилизирующей активности.

ПДК для метанола в почве не разработана, поэтому должен проводиться пересчет данных по водной вытяжке из почвы (в мг/кг почвы) на содержание в почвенном растворе (в мг/л раствора). Содержание метанола в почвенном растворе (мг/л) рекомендуется сравнивать с санитарной нормой для водоемов (ПНДФ 14.1:2.102-97, РД 52.24.423-2006).

Для извлечения метанола из почвы рекомендуется метод экстракции его дистиллированной водой при соотношении почвы к воде 1:3. Пробы отбирают в банку с притертой пробкой (возможно использование плотно завязанных полиэтиленовых пакетов) и анализируют в тот же день. Хранение образцов почвы допускается при температуре не выше 2-3°С в течение 1-2 суток. Перед анализом почву растирают в фарфоровой ступке и просеивают через сито 1-2 мм. Все операции с почвой (растирание, просеивание и взятие навески) проводят в вытяжном шкафу.

Полученные в экспериментах результаты подвергали статистической обработке на компьютере с использованием стандартного пакета программ "Statistica" по общеизвестным методам вариационной статистики с оценкой статистической значимости показателей и различий рассматриваемых выборок по t-критерию Стьюдента. Различия в сравниваемых группах считались достоверными при уровне значимости 95% (p<0,05).

3.      Результаты

3.1.   Выбор штаммов микроорганизмов

Штаммы микроорганизмов биопрепарата выбирали из коллекции ВКПМ обладающих метанолдеструктирующими свойствами и микроорганизмы, способствующие восстановлению ризосферы, находящиеся в открытом доступе:

.        Номер штамма - B2664. Род штамма - Corynebacterium. Вид штамма - sp. Родословная штамма и способ его получения - почва, загрязненная метанолом, ЩПО "Азот".

Оптимальная температура роста - 40°С.

Применение штамма - утилизация метанола.

Среда для переноса штамма (номер) - 113.

Параметры среды: NH4H2PO4 - 2,0; (NH4)2 HPO4 - 0,5; K2SO4 - 0,2; MgSO4x7H2O - 0,2; агар - 20,0; раствор микроэлементов - 0,5мл; вода дист. - 1,0 л; рН=6,8-7,0э

Раствор микроэлементов (г/л): KI - 0,02; H3BO3 - 0,02; MnSO4x5H2O - 0,02; (NH4)6Mo7O24x4H2O - 0,02; FeSO4x7H2O - 0,1; вода дист. - 1,0 л.

Метанол в концентрации 0,5-1% добавляют после стерилизации.

Штамм ВКПМ B-2664 Corynebacterium sp. не является генетически модифицированным штаммом. Штамм Corynebacterium sp. не относится к микроорганизмам, патогенным для человека согласно классификации микроорганизмов, приведенной в Санитарных правилах СП 1.3.2322-08. Работа со штаммом не требует специальных мер предосторожности.

. Номер штамма - В5603. Род штамма - Methylobacterium. Вид штамма - sp. Название (имя) штамма - 1K. Родословная штамма и способ его получения - почва, выделен в 1987 году из ассоциации микроорганизмов, утилизирующих метанол методом накопительных культур с использованием метанола в качестве единственного источника C.

Оптимальная температура роста - 30°С.

Применение штамма - деструкция метанола; очистка сточных вод; категория С.

Среда для переноса штамма (номер) - 234.

Параметры среды: KH2PO4 - 3,0; K2HPO4 - 7,0; NH4NO3 - 1,0; MgCl2 - 0,1; метанол - 5,0 мл; агаp - 15,0; вода дист. - 1,0 л; pH=7,6. Метанол добавить после стерилизации.

Условия культивирования штамма (состав среды, температура и т. д.): (г/л): КН2РО4- 3,0, NH4NO3 - 1,0, MgCl2 - 0,1, *метанол - 5,0 мл, агар - 15,0, вода дист. - 1,0 л; рН=7,6 *Метанол добавить после стерилизации, t -30°С. Инкубация 2-4 суток.

Штамм ВКПМ В-5603 Methylobacterium sp. 1К не является генетически модифицированным штаммом. Штамм Methylobacterium sp. 1К не относится к микроорганизмам, патогенным для человека согласно классификации микроорганизмов, приведенной в Санитарных правилах СП 1.3.2322-08. Работа со штаммом не требует специальных мер предосторожности.

. Номер штамма - В3780.

Род штамма - Acinetobacter. Вид штамма - calcoaceticus. Название (имя) штамма - 134. Имена-синонимы штамма (номера в других коллекциях) - (Pseudomonas sp.). Родословная штамма и способ его получения: сточные воды производства фенолформальдегидных смол.

Оптимальная температура роста - 25 - 28°С.

Применение штамма - деструкция метанола; деструкция формальдегида; деструкция фенола; очистка сточных вод.

Среда для переноса штамма (номер) - 1.

Параметры среды: мясная вода - 1,0л; NaCl - 5,0; пептон - 10,0; агар (если нужно) - 20,0; рН= 6,8-7,0.

Стерилизовать при 1 атм. 30 минут.

Мясная вода: 500 г обезжиренного фарша залить 1л водопроводной воды, проэкстрагировать при 37-39°С в течение 2 часов, отжать через марлю, затем прокипятить 30 минут, отфильтровать через вату и довести объем до 1 л.

Условия культивирования штамма (состав среды, температура и т. д.): МПА; среда L:(г/л): дрож. экстракт - 5,0; пептон - 15,0; NaCl - 5,0; агар - 15,0; вода дист. - 1,0 л., t-25-28°C.

Штамм ВКПМ В-3780 Acinetobactercalcoaceticus 134 не является генетически модифицированным штаммом. Штамм ВКПМ В-3780 Acinetobactercalcoaceticus 134 не относится к микроорганизмам, патогенным для человека согласно классификации микроорганизмов, приведенной в Санитарных правилах СП 1.3.2322-08. Работа со штаммом ВКПМ В-3780 Acinetobactercalcoaceticus 134 не требует специальных мер предосторожности.

. Номер штамма - В5150. Род штамма - Pseudomonas. Вид штамма - putida. Автор(ы) вида или подвида - (Trevisan 1889) Migula 1895. Название (имя) штамма BS-2. Родословная штамма и способ его получения - почва около предприятия газовой промышленности, выделен в 1987г. из ассоциации м/о, утилизирующих диэтиленгликоль методом накопительных культур.

Оптимальная температура роста - 20 - 25°С.

Применение штамма - деструкция диэтиленгликоля; очистка сточных вод.

Среда для переноса штамма (номер) - 1.

Параметры среды: мясная вода - 1,0л; NaCl - 5,0; пептон - 10,0; агар (если нужно) - 20,0; рН= 6,8-7,0.

Стерилизовать при 1 атм. 30 минут.

Мясная вода: 500 г обезжиренного фарша залить 1л водопроводной воды, проэкстрагировать при 37-39°С в течение 2 часов, отжать через марлю, затем прокипятить 30 минут, отфильтровать через вату и довести объем до 1 л.

Условия культивирования штамма - МПА (МПБ), температура культивирования - 20-25°С. Не растет при температуре 37°С. Инкубация 2-4 суток.

Штамм ВКПМ В-5150 Pseudomonasputida BS-2 не является генетически модифицированным штаммом. Штамм ВКПМ В-5150 Pseudomonasputida BS-2 не относится к микроорганизмам, патогенным для человека согласно классификации микроорганизмов, приведенной в Санитарных правилах СП 1.3.2322-08. Работа со штаммом не требует специальных мер предосторожности.

. Номер штамма - Y1246. Род штамма - Candida. Вид штамма - methylica. Автор(ы) вида или подвида - Trotsenkoetal., 1974. Имена-синонимы штамма (номера в других коллекциях) - BKM Y-2356.

Оптимальная температура роста - 28°С.

Применение штамма - способность утилизировать метанол.

Среда для переноса штамма (номер) - 140.

Параметры среды: глюкоза - 20,0; пептон - 10,0; дрож. экстракт - 5,0; агар - 20,0; вода дист. - 1,0 л

Условия культивирования штамма: полная дрожжевая среда (г/л): глюкоза - 20; дрожжевой экстракт - 5; пептон - 10; t = 28°С.

Штамм Candidaboidinii ВКПМ Y-1246 относится к микроорганизмам 4 группы патогенности согласно классификации микроорганизмов, приведенной в Санитарных правилах СП 1.3.2322-08. Работа со штаммом ВКПМ Y-1246 требует специальных мер предосторожности, соответствующих уровню работы с патогенными микроорганизмами 3-4 групп патогенности.

. Номер штамма - В607. Род штамма Bacillus. Вид штамма - megaterium. Автор(ы) вида или подвида - deBary 1884. Имена-синонимы штамма (номера в других коллекциях) - BKM-396, ИHMИA 909. Родословная штамма и способ его получения - серозем, Таджикистан.

Оптимальная температура роста - 30°С.

Применение штамма - категория С.

Среда для переноса штамма (номер) - 1.

Параметры среды: мясная вода - 1,0л; NaCl - 5,0; пептон - 10,0; агар (если нужно) - 20,0; рН= 6,8-7,0.

Стерилизовать при 1 атм. 30 минут.

Мясная вода: 500 г обезжиренного фарша залить 1л водопроводной воды, проэкстрагировать при 37-39°С в течение 2 часов, отжать через марлю, затем прокипятить 30 минут, отфильтровать через вату и довести объем до 1 л.

Условия культивирования штамма (состав среды, температура и т. д.): L-среда (г/л): дрож. экстракт - 5,0, пептон - 15,0, NaCl - 5,0, агар - 15,0, вода дист. - 1,0л, 30°С.

Штамм Bacillusmegaterium ВКПМ В-607 не является генетически модифицированным штаммом. Штамм Bacillusmegaterium ВКПМ-607 относится к микроорганизмам, непатогенным для человека, согласно классификации микроорганизмов, приведенных в Санитарных правилах СП 1.3.2322-08. Работа со штаммом Bacillusmegaterium ВКПМ В-607 не требует специальных мер.

Штамм Bacillusmegaterium ВКМ В-396 (RU 2147181, 2000) входит в состав биопрепарата «Альбит» повышающего урожай растений и защищающего их от болезней. Штамм синтезирует комплекс рост стимулирующих соединений: естественный биополимер поли-бета-гидроксимасляная кислота.

Штамм ВКПМ B-2664 Corynebacterium sp. оказался не жизнеспособным. Штамм Candidaboidinii ВКПМ Y-1246 относится к микроорганизмам 4 группы патогенности, что определило невозможность его использования в биопрепарате. Штамм ВКПМ В-5150 Pseudomonasputida обладает выраженными свойствами деструкции ароматических углеводородов и не является метанолодеструктором.

Учитывая, что метанол, как источник углерода и энергии, используется бактериями, объединенными в группу метилотрофов, выбор штаммов, обладающих метанолутилизирующей способностью, проводился на основе аналитического анализа микроорганизмов, обладающих этим свойством и находящихся на хранении в ВКПМ. В результате были отобраны и приобретены следующие штаммы:

Acinetobactercalcoaceticus, ВКПМ В-3780,

Methylobacterium sp, ВКПМ В-5603.

В качестве почвенного микроорганизма был выбран и приобретен штамм Bacillusmegaterium, ВКПМ В-607.

Наиболее эффективным и экономически выгодным является препарат с клеточным титром 109 колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 г препарата, получивший условное наименование «БИОМ-М».

Увеличение концентрации клеток более 1010 мкл/г не приведет к значительному увеличению скорости деструкции загрязнителя, однако неоправданно увеличит стоимость работ по очистке, так как увеличение скорости биодеструкции будет незначительным по сравнению с увеличением стоимости препарата. При концентрации клеток микроорганизмов менее 107 KOE/г в биопрепарате, технический результат достигнуть не удастся, вследствие снижения требуемой скорости биодеструкции загрязнителя.

3.2.   Выбор компонентов препарата

Выбор компонентов биопрепарата основывался в первую очередь на выборе эффективного сорбента для иммобилизации микроорганизмов биопрепарата, сорбента для использования при контактно-сорбционном обезвоживании биопрепарата, с целью отказаться от высокого затратного способа лиофилизации, ионообменника способствующего восстановлению ризосферы обрабатываемых участков, удобрения для роста растительности на обрабатываемых участках почвы и как следствие более длительного действия микроорганизмов биопрепарата и безопасного для флоры и фауны.