Дипломная (вкр): Оценка метанолутилизирующей активности биопрепарата экологического назначения для очистки окружающей среды от метанола

Все этим требованиям в полной мере отвечает природный алюмосиликат, ионообменник - глауконит.

По решению Международного номенклатурного комитета глауконитом следует называть железистую диоктаэдрическую слюду, неразбухающую, с (Al, Fe3+) IV> 0.2, (Fe3+, Al) IV1.2, Fe3+ ≥ Al.

Отличительной особенностью глауконита от остальных цеолитов в первую очередь является то, что он обладает слоистым строением, благодаря чему площадь активной поверхности значительно увеличивается и самое главное глауконит содержит обширный набор микроэлементов, которыми он может обмениваться по ионообменному принципу, и плюс он содержит в значительном количестве K, являющийся незаменимым удобрением для большинства растений. Еще одно преимущество глауконита, то, что он увеличивает диффузию кислорода и влаги в почве, что обеспечивает оптимальный водный, газо-воздушный и тепловой режим для роста численности микроорганизмов, как иммобилизованных на нем, так и содержащихся в почве. При этом усиливается активность метаболитных ферментов и значительно увеличивается энергия всех биохимических процессов.

Выявлено стимулирующее действие глауконита на развитие полезной микрофлоры почв, определяющих их плодородие. Предпосылкой этому, прежде всего, является высокое содержание в глауконитах оксида калия (от 5,0 до 9,5%), способность его быстро разрушаться в почве с высвобождением калия в виде легко усвояемых соединений. Важным обстоятельством является то, что в глауконитах нередко в значительных количествах присутствуют микроэлементы (Mn, Cu, Co, Ni, B и др.), а многие залежи глауконитовых пород содержат высокую примесь P2O5 и даже включают горизонты фосфоритов. Все это дает основание рассматривать глаукониты как природное минеральное удобрение, позволяющее не только обогащать почву калием, но и улучшать ее структуру, сохранять влагу, стимулировать рост и снижать заболеваемость растений.

Глаукониты обладают высокими адсорбционными и катионообменными свойствами и могут использоваться в качестве адсорбента тяжелых металлов, нефтешламов, загрязняющих водные объекты и почву, а также для ликвидации загрязнений, находящихся в осадках очистных сооружений и промышленных стоков, в грунтах и водных объектах, с помощью площадного внесения и создания геохимических барьеров. Глауконит применяется при реабилитации территорий, пораженных радионуклидами или имеющих высокую техногенную нагрузку в результате деятельности промышленных предприятий.

Высокая поглотительная способность глауконита может быть использована для решения задач инженерной геоэкологии по защите окружающей среды от воздействия различных экотоксикантов, способных интенсивно мигрировать в гидро- и геосфере и тем самым нарушать нормальный ход биохимических процессов.

С помощью глауконита из загрязненных вод практически полностью удаляются соединения аммиака, нейтрализуются соединения кальция и железа. Сорбционные свойства глауконита позволяют осуществить комплексную очистку вод до требований СанПин 2.1.4.1074-01. При этом глауконит не только детоксицирует, но и регулирует кислотность и жесткость любой воды.

В животноводстве и птицеводстве глауконит используется как кормовая добавка (до 30%) и основа конструирования БАД к пище с энтеросорбционными и ионообменными свойствами. Он улучшает обменные процессы, повышает переваримость и усвояемость корма, снижает концентрацию аммиака, микотоксинов и других токсичных компонентов, образующихся в организме при пищеварении и жизнедеятельности, а также поступающих с кормом тяжелых металлов, радионуклидов и других токсикантов, в том числе биологического происхождения; регулирует соотношение кальция и натрия и улучшает снабжение организма железом. Так как он в итоге представляет собой минеральное удобрение, то после применения биопрепарата отпадает необходимость его утилизации.

Глауконит относится к IV группе классификации химических соединений (ГОСТ 12.1.00.76), не обладает кумулятивным, аллергизирующим действием, не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистые оболочки. Биологическая проба, проведенная на белых крысах, показала, что скармливание животным кормов, содержащих 4% глауконита, способствует увеличению массы тела крыс.

В качестве глауконит содержащего носителя может использоваться как чистый глауконит, так и глауконитовую породу, содержащую от 60 до 80% глауконита.

Уникальность свойств глауконита определило его использование как компонента биопрепарата.

3.3.   Конструирование биопрепарата

На основании проведенного аналитического анализа данных литературы была предложена экспериментальная лабораторная пропись метанолутилизирующего препарата «БИОМ-М», состоящая из масс. %: алюмосиликата осадочного происхождения (глауконита) - 89%; аэросила - 1%; биокомпонента, содержащего культуры штаммов метанолутилизаторов - 10%.

Микроорганизмы биопрепарата Bacillusmegaterium ВКПМ B-607; Methylobacterium sp. ВКПМ B-5603; Acinetobactercalcoaceticus ВКПМ B-3780 выращиваются раздельно в биореакторе до содержания 1011-1012 мкл/мл, известными способом и, затем готовят микробную ассоциацию смешиванием в реакторе при 25°С определенного соотношения культуральных жидкостей, до содержания 1012 мкл/мл, полученную микробную ассоциацию захолаживают в реакторе при температуре 14-16°С.

Выращивание культур проводили в цехе культивирования ООО «СИНБИОНТ» г. Киров.

Раздельное культивирование позволяет широко варьировать при конструировании биопрепаратов в отличие от совместного выращивания.

Глауконит препарата измельчается на шаровой мельнице до 50% содержания частиц размером 500-600 мкм, просеивается через сита №600 и досушивается до остаточной влажности 4% при температуре 190°С в сушильных шкафах. Приготовление биопрепарата осуществляется методом контактно сорбционного обезвоживания на глауконите смешивание ассоциации с глауконитом осуществляется, в специализированном смесителе обеспечивающим смешиванием в одном объеме расчетных долей культуральных жидкостей с глауконитом до содержания 109 мкл/мл. Процесс в смесителе осуществляется напылением расчетного количества (10 л) микробного аэрозоля ассоциации микроорганизмов на фонтанирующий слой глауконита (50 кг) при температуре теплоносителя - воздуха (стерильного) 40°С и скорости 10 м/с. Иммобилизация завершается при достижении влажности в конечном биопрепарате 4% и содержании живых бактериальных клеток 109 мкл/г.

Наиболее экономически оправдано проводить процесс при содержании глауконита в носителе не менее 60%.

Следующим этапом конструирования биопрепарата стало установление диапазона метилутилизирующей способности штаммов микроорганизмов, полученных из ВКПМ, уточнение прописи биокомпонента с учетом совместимости микробных культур, их биологической концентрации и внесения дополнительных ингредиентов для улучшения эксплуатационных свойств конечного препарата.

Оценку метанолутилизирующей способности при выращивании на плотной питательной среде проводят на основании способности к формированию колоний при аналогичных условиях выращивания.

Результаты теоретических и экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что отобранные штаммы метилотрофных микроорганизмов Acinetobactercalcoaceticus ВКПМ В-3780 и Methylobacterium sp. ВКПМ В-5603 обладают способностью к росту при культивировании на плотной питательной среде при добавлении в качестве источника углерода 2% метанола.

С учетом полученных результатов исследований на следующем этапе экспериментальных работ было проведено определение минимально подавляющей концентрации метанола, блокирующей полное развитие микробных культур на плотной (пропись 1) питательной среде, в которую после приготовления вносился метанол в концентрации 20, 40, 60, 80, 100, 120 см3/дм3. Концентрация вносимых микробных клеток в реакционную смесь соответствовала аналогичному показателю для экспериментального образца биопрепарата, а также рекомендациям для оценки ингибирующего действия антибиотиков, химиопрепаратов, дезинфектантовinvitro и составляла 1,3х10^8 живых микробов.

Результаты проведенных исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты оценки устойчивости изучаемых штаммов микроорганизмов к метанолу в плотной питательной среде

+ Наличие роста изучаемых микроорганизмов

Отсутствие роста изучаемых микроорганизмов

Наличие жизнеспособности изучаемых микробных штаммов определяли на основании контрольного высева из опытных проб на плотную питательную среду (пропись 2). Заключение о величине минимально подавляющей концентрации при выращивании на плотной питательной среде, содержащей метанол, делали на основании отсутствия роста колоний.

Полученные результаты исследований показали, что величина минимально подавляющей концентрации метанола составляет для штаммов метилотрофов:

Acinetobactercalcoaceticus - 100 см3/дм3;sp. - 120 см3/дм3.

Для культуры Bacillusmegaterium аналогичный показатель соответствовал показателю 40 см3/дм3.

В то же время изучение морфологии микробных клеток в мазках, окрашенных по Грамму, свидетельствовало о том, что при содержании метанола в концентрации 20 см3/дм3 происходит переход изучаемых микроорганизмов из бациллярной формы в споровую.

Оценка совместимости микробных культур, входящих в состав предлагаемого биопрепарата, не выявила взаимного ингибирующего действия отобранных штаммов. На последующем этапе экспериментальных исследований была проведена оценка метанолутилизирующей способности двух вариантов биопрепарата, состоящих из:, Methylobacterium sp. - первый вариант и аналогичный, но с включением Bacillusmegaterium - второй вариант.

При приготовлении первого варианта биопрепарата соотношение культур составляло с учетом исходной концентрации микробов 1х10^9 КОЕ/см3:- 50%;sp. - 50%.

Второй вариант содержал:- 30%;sp. - 60%;- 10%

и соответствовал композиции экспериментального образца, в котором концентрация микробов каждого штамма составляла 1х109 КОЕ/см3.

Заключение о величине ингибирующей дозы делали на основании контрольного высева из реакционной среды на чашки с плотной питательной средой (пропись 2), обеспечивающий формирование колоний исследуемых микроорганизмов на ее поверхности при наличии жизнеспособных клеток. Аналогичный метод использовался при определении минимально подавляющей концентрации метанола при ингибировании изучаемых биокомпонентов на чашках с плотной питательной средой (пропись 1).

Концентрация вносимых микробных клеток в реакционную смесь соответствовала аналогичному показателю для экспериментального образца биопрепарата, а также рекомендациям для оценки антибактериального действия антибактериальных препаратов и дезинфектантовinvitro.

Результаты проведенных исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2. Результаты оценки устойчивости изучаемых композиций метанолутилизаторов к метанолу в плотной питательной среде

+ Наличие роста изучаемых микроорганизмов

Отсутствие роста изучаемых микроорганизмов

При пересеве и выращивании на плотной универсальной накопительной питательной среде определялось формирование колоний всех штаммов, входящих, как в первую, так и во вторую композицию метанолутилизаторов.

Таким образом, проведенные исследования позволяют сделать заключение о возможности использования разработанной композиции биокомпонента при содержании метанола в воде или почве, не превышающие 100 см3/кг (см3/дм3).

3.4.   Экспериментальная оценка возможности применения метанолутилизирующего препарата в морской воде, засоленной почве

Для оценки метанолутилизирующей способности метилотрофов, входящих в состав биопрепарата при наличии в реакционной среде различных концентраций солей (в перерасчете на NaCl), была проведена экспериментальная оценка по определению блокирующей размножение изучаемых микробов величины содержания NaCl в плотной питательной среде (пропись 1), содержащей 100 г метанола на 1 дм3 среды.

При определении количества вносимой соли (NaCl) учитывали имеющиеся данные литературы об аналогичной величине в морях (Черном, Азовском, Балтийском, Каспийском и других), находящихся на территории России, и составляющей максимально 50 г на дм3 воды. На основании этих результатов в питательную среду вносили 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140 г NaCl на 1 дм3 плотной питательной среды (пропись 1). Величина посевной дозы соответствовала количеству микробных клеток, содержащихся в одном грамме биопрепарата. Культивирование осуществляли при температуре 30°С в шуттель-аппарате. По истечении указанного срока для оценки наличия жизнеспособных микроорганизмов производили высев на накопительную плотную питательную среду (пропись 2).

Полученные результаты показали, что величина 120 см3/дм3 NaCl в плотной питательной среде, содержащей метанол, блокирует развитие микроорганизмов, входящих в состав биопрепарата. При внесении 100 см3/дм3 NaCl после инкубирования на плотной питательной среде с последующим высевом на плотную накопительную питательную среду (пропись 2) выявляется рост колоний изучаемых штаммов.

Результаты проведенных исследований представлены в таблице 3.

Таблица 3. Результаты оценки устойчивости изучаемой композиции метанолутилизаторов к действию NaCl