При получении иммобилизованных биопрепаратов суспензию клеток микроорганизмов (обычно до стадии концентрирования) смешивают с носителем (сорбентом). Носитель может быть порошкообразным, гранулированным, волокнистым, тканым. Процедура иммобилизации может предусматривать внесение дополнительных реагентов, флокуляцию, осаждение клеток на носителе и другие приемы, повышающие эффективность иммобилизации. В процессе созревания, длящемся от 2-3 недель до 1,5-2 мес, биомасса микроорганизмов деструкторов нарастает на носителе, увеличиваются титр жизнеспособных клеток, их активность и срок хранения препарата.
Внесение различных добавок (наполнителей, осмопротекторов и других защитных веществ, компонентов питания и т. п.) в полученную биомассу позволяет исключить из технологической схемы стадию сушки, инактивирующую клетки микроорганизмов, стандартизировать характеристики биопрепарата, увеличить срок хранения, выживаемость и активность микроорганизмов, эмульгирующую, диспергирующую, адгезионную, пенообразующую способности, уменьшить слеживаемость.
Задачей разработки технологии применения биопрепаратов является обеспечение необходимых условий (содержание минеральных компонентов, дополнительных субстратов, мелиорантов, наполнителей и других добавок, оптимальные условия влажности, температуры, рН среды, аэрации и др.) для активного развития микроорганизмов биопрепарата в загрязненной среде, использования их биоокислительного потенциала.
Для активации микроорганизмов биопрепаратов (восстановления сниженной жизнеспособности клеток, индукции и повышения активности деструкционных ферментов) перед использованием рекомендуется препараты разводить в водной среде, содержащей питательные компоненты и, возможно, загрязняющее вещество, и выдерживать некоторое время (от нескольких часов до суток), если требуется, при аэрировании среды.
При высокой концентрации загрязнений может потребоваться предварительная обработка среды другими методами. Например, при высоком содержании загрязнения на поверхности почвы сначала механическими способами (бульдозером, лопатами) собирается верхний слой и лишь, затем проводится обработка биопрепаратом. Собранный грунт складируют. Возможна его дальнейшая обработка биопрепаратами на площадках складирования.
Контроль за качеством очистки осуществляют при использовании физико-химических, химико-аналитических и биологических (микробиологических, фитотоксикологических) методов.
По окончании очистных работ проводят рекультивационные мероприятия и при необходимости утилизируют и обезвреживают образовавшиеся отходы.
Биопрепараты для ликвидации загрязнений
Большое количество биопрепаратов разработано для биодеструкции нефти и продуктов ее переработки, загрязняющих природные среды в результате утечек, проливов, разного масштаба экологических катастроф.
Потенциальными потребителями биопрепаратов могут быть промышленные предприятия, нефтедобывающая и нефтеперерабатывающая промышленность, нефтеналивные и заправочные станции ГСМ, подразделения МЧС, автотранспортные предприятия и станции технического обслуживания, предприятия по транспортировке нефти и нефтепродуктов, морские и речные порты, фирмы, специализирующиеся на продаже недвижимости и земельных участков, городские и муниципальные службы и др.
Современные биопрепараты на основе нефтедеструкторов, как правило, предназначаются для очистки не только нефтезагрязненных почв и грунтов, но и пресных водоемов, акваторий морей, стоков промышленных предприятий, внутренних поверхностей технологических резервуаров и танков, обезвреживания нефтесодержащих твердых отходов, рассоления засоленных и загрязненных нефтью почв (на основе смешанных культур галофильных бактерий и бактерий нефтедеструкторов). Часть биопрепаратов рекомендуется для удаления таких загрязнений, как сланцевое масло (используется для пропитки шпал), отработанные машинные и моторные масла, смазочно-охлаждающие жидкости, не подлежащие регенерации и вторичному использованию, пищевые масла и жиры в стоках, а также остаточных нефтепродуктов (котельное топливо, смазочные мазуты, гудроны, вазелины и другие нефтепродукты кубового остатка). Для расширения сферы применения, повышения эффективности использования биопрепаратов в них добавляют различные сорбенты, пенообразователи, эмульгаторы, минеральные и биологические добавки (источники азота, фосфора, микроэлементы, ПАВы, лецитины, биостимуляторы и т. д.).
Биопрепараты на основе смешанных культур и ассоциаций микроорганизмов имеют более широкие адаптационные и экологические возможности для использования и наряду с бактериями или грибами-гетеротрофами могут содержать микроводоросли, цианобактерии.
Преимущество препаратов с носителем - более высокая выживаемость клеток микроорганизмов при хранении, при контакте с повышенными концентрациями загрязнений. Носитель служит своеобразным протектором, обеспечивающим оптимальное микроокружение клеткам. Иммобилизация клеток на носителе позволяет получать препараты комбинированного действия: сорбенты для поглощения и одновременно биологической деструкции загрязнений. Некоторые носители используются с целью повышения плавучести препарата для увеличения времени контакта микроорганизмов-деструкторов с нефтепленкой (при очистке водных поверхностей), адгезивной способности, диспергируемости и других технологически важных характеристик, могут содержать питательные вещества, необходимые для биодеструкционной активности микроорганизмов, компоненты, обеспечивающие пролонгированное высвобождение минеральных соединений азота и фосфора с целью сведения к минимуму возможности избыточного попадания их в водоемы и предотвращения эвтрофикации.
Среди наиболее популярных органических материалов, используемых в качестве носителя и сорбента, - природный торф и различные его модификации, а также сосновая кора, модифицированный мох, древесные стружки, опилки; из синтетических полимерных материалов - пенополиуретан, поликапроамидные волокна и др. Среди неорганических материалов в качестве носителя используются глинистый минерал вермикулит (природный или модифицированный), диатомовая земля, вспученный перлит, вспученный вермикулит, вспененный графит, цеолиты, каолин, керамика и др.
Общий недостаток биопрепаратов с сорбентами - высокий расход и, как следствие, высокая стоимость очистки. Биопрепараты с сорбентами эффективнее использовать при аварийных разливах загрязнения, особенно в городских условиях, когда нужно быстро очистить загрязненный участок. Биопрепарат с сорбированным загрязнением может быть собран и обезврежен на специальных площадках или в биореакторах.
Большинство биопрепаратов производится на основе мезофильных и термотолерантных штаммов микроорганизмов. Однако в холодном климате России при insitu очистке более эффективны психрофильные микроорганизмы. В то же время микроорганизмы, имеющие низкотемпературный оптимум роста, нетехнологичны, при низких температурах их сложно накопить в промышленных условиях. Поэтому для условий России актуальным остается получение биопрепаратов на основе микроорганизмов с максимально широким диапазоном толерантности к температурному фактору, активных при невысоких плюсовых температурах (от 0 до +10 °С). Также важно создание биопрепаратов, предназначенных для ликвидации нефтяных загрязнений в условиях закисления (например, для ликвидации кислых гудронов), которые были бы активны при pH 1-3.
Другая проблема обусловлена тем, что активное начало многих предлагаемых на рынке биопрепаратов составляют спорообразующие культуры, поскольку они более устойчивы к ряду технологических операций, в частности к высушиванию. Такие микроорганизмы быстро переходят в неактивные («покоящиеся») формы при возникновении условий, отличных от оптимальных, длительно находятся в неактивном состоянии, длительно переходят в вегетативное состояние при возникновении благоприятных условий. Переход в активное состояние требует оптимальных параметров, которых часто в природных условиях достигнуть сложно. Это ведет к увеличению расхода биопрепаратов и стоимости очистки.
Кроме биопрепаратов, предназначенных для очистки сред от нефти, начинают находить все большее применение и биопрепараты для очистки от других загрязнений, таких как фенолы, другие классы ароматических и гетероциклических соединений, хлорорганических соединений, пестицидов.
Для извлечения радионуклидов и тяжелых металлов могут быть использованы биосорбенты, получаемые из микробной биомассы и отходов микробиологического производства, в частности из биомассы мицелиальных грибов.
Микробные системы конструируют таким образом, чтобы они обладали наибольшим разнообразием путей метаболизма участвующих в деструкции ксенобиотиков, синтезировали вещества, например, биосурфактанты, способствующие биодоступности загрязнений, могли бы активно функционировать в различных физико-химических условиях окружающей среды, были безопасны для человека, легко элиминировались из природной среды после удаления контаминантов.
Использование генетически модифицированных микроорганизмов в настоящее время в большинстве стран разрешено лишь для проведения полевых экспериментов.
Биопрепараты для рекультивации территорий и восстановления плодородия почв
Рекультивация - комплекс мероприятий, направленных на восстановление плодородия и практической ценности нарушенных земель, почвенного покрова, естественного экологического равновесия ранее загрязненных или выведенных из хозяйственного использования территорий.
Почвы могут не содержать опасных концентраций загрязнений, но их
механическая структура может быть нарушена, изменены физико-химические
свойства, снижены содержание биогенных элементов и активность биоты, ухудшено
фитосанитарное состояние почв и посевов растений, т. е. в целом нарушено
плодородие почвы. Биопрепараты, предназначенные для рекультивации, активизируют
почвенные процессы, направленные на восстановление ее плодородия.
Работа выполнена на базе кафедры иммунологии и биотехнологии ФГБОУ ВО
МГАВМиБ - МВА имени К. И. Скрябина, а также на базе ООО «Синбионт» г. Киров,
ФГУП «ВНИИПРХ».
Штаммы были получены из коллекции штаммов Всероссийской Коллекции
Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИ Генетика.
Регистрационный номер в коллекции: ВКПМ В-3780.
Происхождение штамма: сточные воды производства фенолформальдегидных смол.
Культурально-морфологические признаки штамма: грамотрицательные палочки, спор не образуют, аэробы.
Область промышленного применения штамма: деструкция метанола, фенола и формальдегида.
Условия культивирования штамма (состав среды, температура и т. д.): МПА; среда L: (г/л): дрожжевой экстракт-5,0; пептон-15,0; NaCl-5,0; агар-15,0; вода дист-1,0 л., t-25-28°C.
Сведения о безопасности использования штамма:
Штамм ВКПМ В-3780 Acinetobactercalcoaceticus 134 не является генетически модифицированным штаммом.
Штамм ВКПМ В-3780 Acinetobactercalcoaceticus 134 не относится к
микроорганизмам, патогенным для человека согласно классификации
микроорганизмов, приведенной в Санитарных правилах СП 1.3.2322-08. Работа со
штаммом ВКПМ В-3780 Acinetobactercalcoaceticus 134 не требует специальных мер
предосторожности.
Регистрационный номер в коллекции: ВКПМ В-5603
Происхождение штамма: почва, выделен в 1987 году из ассоциации м/о, утилизирующих метанол методом накопительных культур с использованием метанола в качестве единственного источника С.
Условия культивирования штамма (состав среды, температура и т. д.): (г/л): КН2РО4 - 3,0, NH4NO3 - 1,0, MgCl2 - 0,1, *метанол - 5,0 мл, агар - 15,0, вода дист. - 1,0л рН=7,6, *Метанол добавить после стерилизации, t -30°. Инкубация 2-4 суток.
Культурально-морфологические признаки штамма: грамотрицательные палочки, подвижные.
Область промышленного применения штамма: деструкция метанола.
Сведения о безопасности использования штамма:
Штамм ВКПМ В-5603 Methylobacterium sp. 1К не является генетически модифицированным штаммом.
Штамм Methylobacterium sp. 1К не относится к микроорганизмам, патогенным
для человека согласно классификации микроорганизмов, приведенной в Санитарных
правилах СП 1.3.2322-08. Работа со штаммом не требует специальных мер предосторожности.
Регистрационный номер в коллекции: ВКПМ В-607.
Происхождение штамма: ВКМ В-396.
Культурально-морфологические признаки штамма: клетки крупные палочки с закругленными концами, расположенные одиночно, парами, цепочками. Колонии серовато-белого цвета, матовые.
Условия культивирования штамма (состав среды, температура и т. д.): L-среда (г/л): дрожжевой экстракт - 5,0, пептон - 15,0, NaCl - 5,0, агар - 15,0, вода диет. - 1,0л, 300 С.
Сведения о безопасности использования штамма:
Штамм Bacillusmegatenum ВКПМ В-607 не является генетически модифицированным штаммом.
Штамм Bacillusmegaterium ВКПМ-607 относится к микроорганизмам,
непатогенным для человека, согласно классификации микроорганизмов, приведенных
в Санитарных правилах СП 1.3.2322-08. Работа со штаммом Bacillusmegaterium ВКПМ
В-607 не требует специальных мер предосторожности.
Пропись 1
Плотная питательная среда Ворошиловой - Диановой с добавлением метанола.
Состав среды (г/л):
Калий фосфорнокислый однозамещенный (KH2PO4) - 1,2;
Калий фосфорнокислый двузамещенный (K2HPO4) - 3,8;
Аммоний сернокислый ((NH4)2SO4) - 1,0;
Магний сернокислый (MgSO4) - 2,0;
Хлористый кальций (CaCl26H2O) - 0,01;
Сернокислое железо (Fe2(SO4)37H2O) - 0,0013;
Агар микробиологический - 20;
рН - 7,2-7,4 ед. рН.
Все компоненты среды помещали в стеклянную колбу, доводили дистиллированной водой до нужного объема, тщательно перемешивали и автоклавировали при (121,0±1,0)°С в течение 15 минут. Затем среду охлаждали до комнатной температуры и вносили метанол в необходимых концентрациях, перемешивали и стерильно разливали в чашки Петри. Чашки хранили при комнатной температуре, не переворачивая.
Пропись 2
Плотная питательная среда FT-агар.
Состав основы (г/л):
Сернокислотный гидролизат рыбной муки -17,0;
Стимулятор роста гемофильных микроорганизмов - 5,0;
Экстракт пекарских дрожжей - 2,3;
Магний сернокислый (MgSO47H2O) - 0,5;
Натрий сернокислый (Na2SO4) - 0,7;
Цистеин гидрохлорид - 0,5;
Агар микробиологический - 15,0;
рН - 7,0±0,2 ед. рН.
Способ приготовления:
г основных компонентов среды размешивается в 970 мл дистиллированной воды
и автоклавируется при (121±1)°С в течение 15 минут. Полученную основу среды
охлаждают до температуры 45...50°С и вносят в нее 20 см3 на 1 дм3 глюкозо-витаминной
добавки, перемешивают и разливают в чашки, пробирки или матрацы.
Ампулы с культурами штаммов метанолутилизирующих микроорганизмов тщательно протирают стерильным ватным тампоном, смоченным 70 %-ным этиловым спиртом. После этого ампулы вскрывают над пламенем спиртовки и вводят стерильный физиологический раствор до исходного объема культуры до сушки. Полученную суспензию высевают по 0,1 мл на скошенную плотную питательную среду и по 0,2 мл на жидкую питательную среду в колбах и выращивают при температуре 28-30°С в течение 48-96 часов.
Культуры, выросшие на скошенной в пробирках плотной питательной среде, используются для выращивания биомассы культур метанолутилизаторов на скошенной плотной питательной среде в матрацах.
Для выращивания культур штаммов метанолутилизаторов на скошенной плотной питательной среде в матрацах используются микробные суспензии, смытые с поверхности плотной питательной среды 10,0 см физиологического раствора.
В каждый матрац вносят по 10,0 см посевного материала, который равномерно распределяют по поверхности плотной питательной среды, скошенной в матраце. Инкубирование осуществляют 48-96 часов при температуре 28-30 °С.
Процесс приготовления микробной взвеси в защитной среде включает смыв микробной культуры с поверхности плотной питательной среды в матрацах защитной средой и розлив полученных рабочих культур во флаконы емкостью 10,0 см.
С этой целью в каждый матрац вносят по 20-25 дм3 защитной среды и по 15-20 штук стеклянных или фарфоровых бус. Культуру с матрацев смывают их покачиванием в горизонтальном положении, не допуская при этом смачивания ватно-марлевых пробок. Полученную суспензию переносят в колбу после проверки наличия посторонней микрофлоры и заключения о ее отсутствии по данным микроскопии.