Материал: Орлов-ВЭЖХ

10

N+(CH3)3Cl- или N+(CH3)3OH-

для разделения анионов (обмениваются Cl- или ОН- на анализируемые анионы F-, Cl-,

NO3-, SO4-, PO4- и т.д.)

SO3-H+ - для разделения катионов (обычно металлов) Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Fe3+, Cu2+ и т.д. Обмениваемый ион - Н+.

Силикагель применяется редко, так как смола должна быть устойчива в кислой и щелочной среде, где силикагель не стоек, а условия разделения оптимальны.

Основное применение ИОХ:

анализ анионов в технологии и экологии;

анализ металлов в технологии, воде, окружающей среде;

ядерная физика, анализ белков и нуклеиновых кислот.

3.3. Гель-проникающая хроматография.

Основная область применения гель-проникающей (эксклюзионной) хроматографии - анализ полимеров по молекулярному весу молекул. Известно, что полимер - длинноцепочечные молекулы, состоящие из разного числа одинаковых фрагментов. Чем ближе размеры молекул друг к другу, тем однороднее полимер, тем выше его качество. Относительное количество молекул каждой молекулярной массы представляет собой важную характеристику - молекулярно-массовое распределение полимера. Получить эту характеристику можно с помощью гель проникающей хроматографии.

Принцип разделения состоит в следующем: молекулы пробы проникают внутрь заполненных растворителем пор сорбента и задерживаются там на разное время. Если молекула имеет очень большой размер, то она вообще не проникает в поры и проскакивает через колонку не удерживаясь. Поры сорбента имеют разброс по размерам. Более мелкие молекулы пробы задерживаются в части пор, потом вымываются из них растворителем. Они через колонку пройдут медленнее, чем первые. Еще более мелкие частицы еще дольше будут проходить через колонку, так как количество доступных для них пор еще больше. Дольше всех проходят через колонку самые мелкие частицы (растворитель).

Таким образом обеспечивается разделение частиц (молекул) по размерам. Калибровочная кривая процесса протекания молекул в поры имеет вид (рис 7).

Рис 7

Размер молекул

А

∆RJ

11

Сорбенты: стекла (макропористые), силикагель, полистирол. Детектор: RJ. Больше колонка - лучше разделение.

IV. СОРБЕНТЫ.

Становление ВЭЖХ в значительной мере связано с созданием новых поколений сорбентов с хорошими кинетическими свойствами и разнообразными термодинамическими свойствами.

Основной материал для сорбентов в ЖАХ - силикагель. Он механически прочен, обладает значительной пористостью, что дает большую обменную емкость при небольших размерах колонки. Наиболее ходовой размер частиц 5-10 мкм. Чем ближе к шарообразной форма частиц, тем меньше сопротивление потоку, выше эффективность, особенно, если от-

сеяна очень узкая фракция (например 7+1мкм). Удельная поверхность силикагеля 10-600 м2/г.

Силикагель может быть модифицирован различными химическими группами, привитыми к поверхности ( С-18, CN, NH2, SO3H ), что позволяет использовать сорбенты на его основе для разделения самых различных классов соединений.

Основной недостаток силикагеля - малая химическая стойкость при рН<2 и рН>9 (кремнезем растворяется в щелочах и кислотах). Поэтому в настоящее время идет интенсивный поиск сорбентов на базе полимеров, стойких при рН от 1 до 14, например, на основе полиметилметакрилата, полистирола и т.д. (в Чехии, США, Германии).

Сорбенты для ионообменной хроматографии.

В силу особенностей разделения (в кислой или щелочной среде) основной материал сорбентов - полистирол с дивинилбензолом различной степени сшивки с привитыми к их поверхности группами SO3-H+ (сильнокислые катионообменники) или -СОО-Na+ (слабокислые катионообменники), -СН2N+(CH3)3Cl- (сильноосновные анионообменники) или - N+HR2Cl- (слабоосновные анионообменники).

Обменная емкость ионообменников для классической ИОХ 2-5 мгэкв/г, для ИХ - 0.001-0.05 мгэкв/г. Марки применяемых сорбентов: КУ-2, АВ-17, КанКАст, КанККст, Диасорбсульфо, ХИКС-1, ВАРС-1.

Сорбенты для гель проникающей хроматографии.

Основной тип - стирол-ДВБ. Используются также макропористые стекла, метилметакрилат, силикагель. Для ионо-эксклюзионной хроматографии используются те же сорбенты.

Сорбенты - самое слабое место отечественных производителей хроматографов. Практически ничего не выпускается, выбора нет, качества нет. Приходится переходить на дорогие зарубежные сорбенты.

V. ОБЩАЯ СХЕМА ЖИДКОСТНОГО ХРОМАТОГРАФА

Хотя жидкостная хроматография - это метод разделения пробы на компоненты, современный жидкостный хроматограф включает в себя не только систему разделения, но и систему количественного измерения содержания каждого компонента, т.е. систему детектирования (вместе с системой обработки хроматографического сигнала).

12

Для обеспечения анализа многокомпонентных смесей с высокой чувствительностью жидкостный хроматограф должен иметь в своем составе ряд блоков.

Самая общая схема жидкостного хроматографа приведена на рис. 8. В состав любого хроматографа входят пять обязательных составных частей:

а) насос для подачи подвижной фазы через колонку; б) дозатор для введения пробы в колонку; в) разделительная колонка - сердце хроматографа;

г) детектор - устройство для получения аналитического сигнала, пропорционального концентрации компонента;

д) система обработки - преобразователь аналитического сигнала в форму удобную для восприятия человеком (или системой автоматического управления).

Всостав хроматографа для удобства работы и расширения его аналитических возможностей могут входить ряд дополнительных устройств.

1) Устройство подготовки подвижной фазы. Функции - фильтрование и дегазация растворителей. Фильтрование - методом пропускания растворителя через фильтр 0.2-0.5 мкм перед заливкой его в емкость, или методом установки на входе насоса фильтра с небольшим сопротивлением. Дегазация - вакуум (из банки) или нагреванием, или пропусканием через растворитель инертного газа (Гелий).

2) Термостат колонок.

Адсорбция в ЖХ и ГХ - процесс термодинамический, зависит от температуры. Следовательно, величина удерживания зависит от температуры. Кроме того, от температуры зависит вязкость растворителя, что определяет эффективность колонки. Таким образом, все три основные характеристики колонки: селективность, емкость и эффективность зависят от температуры. Для стабилизации условий разделения, чтобы получить воспроизводимые време-

на удерживания, амплитуды пиков и хорошее разделение необходимо термостатирование колонок. Обычно температура термостата 30-50 оС, стабильность поддержания температуры

-0.3-0.5оС. Как видно, условия разделения очень мягкие, не то что в ГХ (100-300оС). Многие жидкостные хроматографы не имеют термостатов, так как колебания температуры в комнате не очень велики и воспроизводимость показаний приемлемая.

3) Послеколоночный реактор.

Вряде случаев трудно найти подходящий способ прямого детектирования выходящих из колонки компонентов (анализ аминокислот, определение тяжелых металлов и т.д.). В этом случае после колонки ставится реактор, где смешивается реагент и разделенные вещества (например, металлы). При этом получают интенсивно окрашенное соединение, которое можно детектировать на фотометре.

4) Автоматический дозатор (автосамплер).

Автоматический дозатор необходим в случае многократного повторения анализа больших серий однотипных образцов. При этом используется один расход растворителя, одна колонка. После окончания анализа (выхода последнего пика) производится автоматиче-

13

ский ввод следующей пробы. Сами пробы предварительно заливаются в ампулы, ампулы устанавливаются на специальном столике. Специальный насос засасывает из ампулы пробу, прокачивает ее через пробоотборную петлю дозатора. При повороте дозатора петля промывается элюентом и проба попадает в колонку.

5) Градиентное устройство.

В ряде случаев при разделении сложных смесей необходимо в процессе разделения изменять состав растворителя по определенному закону для ускорения анализа и улучшения разделения. Эту роль выполняет градиентное устройство.

Все основные узлы жидкостного хроматографа связаны между собой гидравлическими связями (насос - дозатор - детектор). Для этих целей обычно используются капилляры из нержавеющей стали внутренним диаметром 0.2-0.3 мм, наружным диаметром 1.0-1.6 мм. Эти капилляры могут выдерживать давление до 1000 атм., достаточно гибки и в условиях ЖАХ и в условиях ГХ не поддаются коррозии. Однако в ионообменной и ионной хроматографии коррозионная стойкость нержавеющей стали мала, происходит реакция железа, марганца, никеля, кобальта с реагентами, что вносит существенные помехи при определении этих металлов в пробе. В этом случае капилляры выполняются из титан-циркониевых сплавов. В последнее время за рубежом получили распространение капилляры из полиэтерэтеркетона (РЕЕК), обладающих высокой коррозионной стойкостью и большой механической прочностью (держат давление до 300-400 кгс/см2). Однако их стоимость в 4-5 раза выше, чем у титановых капилляров. Применение фторопластовых капилляров себя не оправдало из-за их малой механической прочности.

Сорбенты , используемые в ЖХ, характеризуются высокой скоростью массопередачи, что достигается, главным образом, уменьшением размера частиц сорбента. Это позволяет работать при высоких линейных скоростях потока подвижной фазы, что резко сокращает время анализа. Но при малых размерах частиц сорбента высокая скорость потока через колонку может быть реализована в случае, если растворитель подается в колонку под высоким давлением (до 150-250 атм.).

Для обеспечения высокой скорости разделения колонки в ЖХ имеют небольшой размер. Но, чем меньше колонка, тем меньше, для исключения перегрузок, должен быть объем вводимой пробы (не более 1% от объема колонки). При этом уменьшается и объем растворителя, соответствующего хроматографическому пику. Для исключения расширения пика в детекторе объем детектора должен быть не более 10% от объема минимального пика (не более 10 мкл). Так как пробы вводится в дозатор очень мало, то детектор в ЖХ должен иметь высокую чувствительность.

Суммируя все эти данные, можно сформулировать требования к жидкостному хроматографу. В таблице 1 представлены характеристики типичной хроматографической колонки (а отсюда и характеристики прибора в целом).

14

VI. НАСОСЫ.

Для обеспечения расхода подвижной фазы через колонку с указанными параметрами используются насосы высокого давления.

К наиболее важным техническим характеристикам насосов для ЖХ относятся: диапазон расхода; максимальное рабочее давление; воспроизводимость расхода; диапазон пульсаций подачи растворителя.

По характеру подачи растворителя насосы могут быть постоянной подачи (расхода) и постоянного давления. В основном при аналитической работе используется режим постоянного расхода, при заполнении колонок - постоянного давления.

По принципу действия насосы делятся на шприцевые и на плунжерные возвратнопоступательные.

На дозатор

Принцип действия.

Блок управления БУ подает напряжение на двигатель Д, определяющее скорость и направление его вращения. Вращение двигателя с помощью редуктора Р преобразуется в перемещение поршня П внутри цилиндра Д. Работа насоса осуществляется в 2 цикла. В цикл заполнения клапан К2 закрыт, К1 - открыт, растворитель поступает из резервуара в цилиндр Ц. В режиме подачи клапан К1 закрыт, а через клапан К2 подвижная фаза поступает в дозирующее устройство.

Для насосов этого типа характерно практически полное отсутствие пульсаций потока подвижной фазы в ходе работы.

Недостатки насоса:

а) большой расход времени и растворителя на промывку при смене растворителя; б) приостановка разделения во время заполнения насоса;

в) большие габариты и вес при обеспечении большого расхода и давления (нужен мощный двигатель и большое усилие поршня с его большой площадью).

Плунжерные возвратно-поступательные насосы.

( Цвет, Hewlett Packard, Perkin-Elmer и т.д.)

Рис 10