Материал: Орлов-ВЭЖХ

15

К1

Принцип действия.

Двигатель Д через редуктор Р приводит в возвратно-поступательное движение плунжер П, перемещающийся в рабочей головке насоса. Клапаны К1 и К2 открываются, когда насос находится в фазе всасывания и подачи соответственно. Величина объемной подачи определяется тремя параметрами: диаметром плунжера (обычно 3.13; 5.0; 7.0 мм), его амплитудой (12-18 мм)и частотой(что зависит от скорости вращения двигателя и редуктора).

Насосы этого типа обеспечивают постоянную объемную подачу подвижной фазы длительное время. Максимальное рабочее давление 300-500 атм, расход 0.01-10 мл/мин. Воспроизводимость объемной подачи -0.5%. Основной недостаток - растворитель подается в систему в виде серии последовательных импульсов, поэтому существуют пульсации давления и потока. Это является основной причиной повышенного шума и снижения чувствительности почти всех детекторов, применяемых в ЖХ, особенно электрохимического.

Способы борьбы с пульсациями. 1. Сдвоенные насосы.

всасывание насос 1

подача насос 2

всасывание насос 2

насос 1 + насос 2

Схема двухплунжерного насоса Баглая.

Чем меньше диаметр плунжера, меньше его ход - меньше пульсации. Рис 11.

К дозатору

от резервуара с элюентом

2. Применение демпфирующих устройств.

Это спиральные трубки специального профиля из нержавеющей стали, включенные последовательно или параллельно в систему между насосом и дозатором.

Рис 12 Профиль демпфера

Демпфер раскручивается при увеличении давления в нем (ускорение хода насоса). При спаде давления он скручивается, его объем уменьшается, он выдавливает из себя часть растворителя, поддерживая постоянным расход и уменьшая пульсации. Такой демпфер хорошо работает при давлении 50 атм и выше. При давления 5-30 атм лучше сглаживает пульсации воздушный демпфер, изготовленный из колонки (рис 13.). Воздух в заглушенной колонке (6х200 мм) сжимается и пульсации гасятся. Воздух в нем растворяется за 24 часа.

Рис 13.

воздух

3. Применение электронных устройств.

При использовании электронного датчика давления можно использовать показания датчика для управления работой насоса. При спаде давления увеличивается скорость вращения двигателя и компенсирует уменьшение давления. Также можно скомпенсировать утечки в клапанах и частично в манжетах. Применение электронного демпфера (БПЖ-80, ХПЖ-1 и т.д.) позволяет снизить пульсации давления до 1 атм при давлении 100-150 кгс/см2.

VII. ДОЗАТОРЫ

Назначение дозатора заключается в переносе пробы, находящейся при атмосферном давлении, на вход колонки, находящейся при давлении вплоть до нескольких атмосфер. Важно, чтобы в дозаторе отсутствовали непромываемые подвижной фазой “мертвые” объемы и размывание пробы в ходе дозирования.

17

На первых порах дозаторы в ЖХ были аналогичны газовым с проколом мембраны. Однако более 50-100 атм мембраны не держат, химическая стойкость их недостаточна, их кусочки загрязняют фильтры колонок и капилляры.

Вжидкой фазе гораздо меньше скорости диффузии, чем в газовой. Поэтому можно дозировать с остановкой потока - проба не успевает размыться в дозаторе. На время ввода в

дозатор пробы специальный кран перекрывает поток растворителя. Давление на входе в колонку быстро снижается, через несколько секунд пробу можно вводить в камеру дозатора обычным микрошприцем. Далее дозатор запирается, включается поток растворителя, идет разделение. Давление, которое держит этот кран, до 500-800 атм. Но при остановке потока нарушается равновесие в колонке, что может приводить к появлению “вакантных” дополнительных пиков.

В“Милихроме” дозатором служит сам насос (при его обратном ходе засасывается

проба).

Наибольшее распространение получили петлевые дозаторы (рис. 14).

При заполнении дозатора под высоким давлением оказываются входы 1,2 и канал между ними. Входы 3-6, каналы между ними и дозирующая петля оказываются под атмосферным давлением, что позволяет заполнить петлю с помощью шприца или насоса. При повороте дозатора поток подвижной фазы вытесняет пробу в колонку. Для снижения погрешности петля промывается 5-10-ти кратным объемом пробы. Если пробы мало то ее можно ввести в

петлю микрошприцем. Объем петли обычно 5-50 мкл.

VIII. КОЛОНКИ

Успех ВЭЖХ обусловлен не только созданием сорбентов, но и колонок, учитывающих особенности процесса разделения в ЖХ. Наиболее важны 2 момента:

1.Создание максимально однородного слоя сорбента в цилиндрической трубке.

2.Сведение к минимуму мертвых объемов в колонке и соединительных трубках.

В аналитической практике в основном используются колонки внутренним диаметром 3-5 мм, длиной 5-25 см. На Милихроме d 2мм, что экономит подвижную фазу, но требует снижения в 4 раза мертвых объемов в системе (капилляры + детектор).

8.1. Устройство аналитических колонок.

Аналитическая колонка представляет собой трубку из нержавеющей стали, титана или стекла, заполненную сорбентом и закрытую с обеих сторон фильтрами для предотвращения высыпания сорбента. Фильтры имеют диаметр пор 2-5 мкм, что не создает сопротив-

18

ления потоку. Для получения высокой эффективности колонок необходимо соблюдение некоторых условий:

1.Внутренняя поверхность колонки должна быть зеркально гладкой.

2.Сорбент должен иметь однородную фракцию (5+1мкм).

3.Переход от большого диаметра колонки к малому диаметру штуцера должен быть плавный, т.е. нужна конусная выточка в корпусе штуцера (рис 15).

Рис 15

фильтр

штуцер

сорбент

4.Стенка колонки должна быть достаточно прочной, чтобы выдержать давление 300-

500 атм.

5.Между торцом колонки и фильтром не должно быть мертвого объема (воздушного зазора), что очень трудно обеспечить в соединениях типа “свагелок”.

Учитывая уникальные свойства сорбентов, сложную конструкцию колонок, тщательность набивки колонок и их тестирование, стоимость колонок составляет 1000-1500 долл.США (отечественные колонки 1 млн. руб.). Поэтому крайне желательно беречь колонки, предохранять от загрязнений с помощью предколонок, заполненных тем же сорбентом, но длиной 30-70 мм.

8.2. Заполнение колонок.

Приготовление хороших колонок является трудновоспроизводимой процедурой. Лишь многолетний опыт позволяет достичь повторяющихся хороших результатов.

Колонки с размером частиц > 50мкм можно упаковывать “всухую”, насыпая шпателем сорбент в колонку. Обычно так набиваются подавительные колонки для ионной хроматографии. После пропускания элюента через колонку сорбент набухнет и колонка будет плотно упакованной.

При размере частиц <50 мкм набивка производится суспензионным способом. Самый простой способ заполнения колонок для ЖХ, сорбент силикагель: готовят сус-

пензию - 5-10% сорбента в воде или изопропиловом спирте, количество сорбента на 20% больше, чем нужно для заполнения колонки (плотность сорбента - 0.5 г/см3, объем колонки можно вычислить по размерам). Минут 10 перемешивают суспензию на магнитной мешалке. В это время колонку чистят ваткой с этанолом, заворачивают нижний штуцер с фильтром, заполняют пустую колонку растворителем (для того чтобы он не вытекал из колонки, к ее выходу подсоединяют капилляр, верхний конец которого выше колонки), соединяют верх колонки с прилагаемым к прибору наполнителем, далее выливают в наполнитель всю суспензию, закрывают наполнитель штуцером, к которому подсоединяют капилляр от насоса и дают максимальный расход (6-7 мл/мин) Первые 10 мин-15 мин насос работает на максимальном расходе, потом каждую минуту снижают расход на 1 мл/мин. Далее, снимают колонку. Смотрят, нет ли ямки у верха колонки, если есть, то колонку перебивают, добавив

19

сорбента. Если нет , то кладут немного стекловаты на верх сорбента и наворачивают верхний штуцер. Колонку ставят в прибор, чтобы элюент протекал в том же направлении, в котором производилась набивка.

Очень важным условием получения хороших колонок является седиментация сорбента: частички 1-2мкм забивают фильтры, снижают эффективность.

Чтобы колонка не “садилась” ,необходимо производить набивку колонки при давлении в 3-4 раза выше ее рабочего давления (т.е. 300-400 кгс/см2).

Для хорошей колонки N=30000-100000 т.т./м.

IX. ДЕТЕКТОРЫ.

Детектор является преобразователем концентрации анализируемого вещества, растворенного в подвижной фазе, в электрический сигнал.

В первых жидкостных хроматографах (типа ионообменных хроматографов) прошедшая через колонку подвижная фаза с компонентами пробы просто собиралась в небольшие сосуды, а затем методами титриметрии, колориметрии, полярографии и т.д. определялось содержание компонента в этой порции. Т.е. процессы разделения пробы и определения ее количественного состава были разделены во времени и пространстве. В современном жидкостном хроматографе эти процессы объединены в одном приборе.

Для детектирования компонентов пробы может быть использовано любое физикохимическое свойство подвижной фазы (поглощение света, излучение света, электропроводность, показатель преломления и т.д.), которое изменяется при наличии в ней молекул разделяемых соединений. Из существующих 50 физико-химических методов детектирования в настоящее время активно используется 5-6.

Наибольшей сложностью при конструировании хроматографических детекторов было сочетание малых объемов ячеек (0.1-10 мкл, менее 10% от объема неудерживаемого пика) с высокой чувствительностью (ввиду малого объема и низкой концентрации пробы). Иллюстрацией достигнутых успехов является то, что чувствительность фотоколориметров и спектрофотометров составляет 10-2 ед.опт. пл-ти, в то время как чувствительность фотометрических детекторов - 10-5 ед.опт. пл-ти, т.е. в 1000 раз выше.

Чувствительность - это важнейшая характеристика детектора. Лучше всего оценивать этот параметр по физической величине. Если определять чувствительность через двойную амплитуду шума нулевой линии, шум выражать в физических единицах, то чувствительность фотометрического детектора будет выражаться в единицах оптической плотности, рефрактометрического - в единицах показателя преломления, вольт-амперометрического- в амперах, кондуктометрического - в сименсах. Для химика, очевидно, интереснее определять чувствительность в минимальном количестве определяемого вещества.

Из таблицы 2 можно оценить предельную чувствительность различных типов детек-

торов.

Чувствительность детектора может быть примерно одинаковой ко всем компонентам пробы (рефрактометр и кондуктометр), а может быть совершенно разной даже для близких соединений. В первом случае говорят о неселективном детектировании. Это значит, что измеряется физическое свойство, присущее и пробе и растворителю (показатель преломления, электропроводность), их разность. Во втором случае - селективное детектирование. Это значит, что измеряется физическое свойство, присущее только молекулам пробы, например, способность флуоресцировать или поглощать свет. Селективное детектирование, с одной стороны, позволяет повысить чувствительность определения или исключить те вещества, которые определять не нужно (предельные углеводороды при определении ароматики), с другой стороны, допускает возможность не обнаружить нужных нам компонентов (тех же предельных в нефти). Поэтому при исследовании общего состава объекта лучше использовать