располагающийся на значительном расстоянии от контролируемых им генов триптофанового оперона. Такие мутанты являются конститутивными вследствие либо полного отсутствия репрессора, либо в результате невозможности последнего активироваться триптофаном.
Таким образом, изменяя регуляцию индуцибельных и репрессибельных оперонов, существует возможность повышать продукционную активность определенных промышленных штаммовпродуцентов. Уместно отметить, что структурные гены одного метаболического пути не всегда объединены в единый оперон (наподобие лактозному), однако это не мешает их регуляции с помощью индукции или репрессии. Так, например, гены E.coli, детерминирующие структуру ферментов, обеспечивающих биосинтез аргинина, располагаются в различных областях хромосомы, но все контролируются одним и тем же геном-регулятором. Такая система образует регулон. Другим показательным примером является SOS-регулон, гены которого детерминируют структуру более десятка различных белков и ферментов, участвующих в репарации повреждений ДНК клетки. Все эти структурные гены регулируются одним репрессором – продуктом гена lехА. Опероны и регулоны, контролирующие взаимосвязанные физиологические функции обнаружены у всех генетически изученных видов бактерий.
Очень важным регуляторным элементом любого оперона является область ДНК, именуемая промотором. Этот участок оперона обеспечивает взаимодействие (связывание) с РНК-полимеразой для начала транскрипции (т. е. синтеза молекулы информационной РНК). От особенностей промотора зависит эффективность транскрипции. Мутации в области промотора, изменяя его активность, могут повышать или понижать экспрессию оперона. Данное свойство промоторов также используется в создании более активных продуцентов.
Большие перспективы в селекции продуцентов открывает генетическая инженерия, методы которой позволяют заменять регуляторные области катаболических оперонов на более эффективные промоторы, повышающие продукцию клетками биологически активных веществ и оюбеспечивающие новые возможности контроля активности генов.
Само собой разумеется, что это не единственные способы повышения продуктивности бактерий за счет изменения регуляторных механизмов.
26
3
Технология ферментационных процессов
При ферментационной технологии можно использовать цельные живые клетки (микробов, клетки животных и растений) или какие-нибудь клеточные компоненты (например, ферменты) с целью физических или химических преобразований органических веществ. Однако недостаточно получать требуемые изменения веществ, метод должен иметь преимущества перед другими, применяемыми в настоящее время, технологиями производства этих же самых продуктов.
Преимущества производства органических продуктов биотехнологическими способами перед чисто химическими методами достаточно многогранны:
•многие сложные органические молекулы, такие, как белки и антибиотики, не могут практически быть синтезированы химическими способами;
•биоконверсия обеспечивает значительно больший выход целевого продукта;
•биологические системы функционируют при более низких температурах, менее высоких значениях рН (близких к нейтральному) и т. п.;
•каталитические биологические реакции намного специфичнее, чем реакции химического катализа;
•биологические процессы обеспечивают почти исключительно продукцию чистых изомеров одного типа, а не их смесей, как это часто бывает в реакциях химического синтеза.
Но вместе с тем биологические способы в сравнении с химическими методами обладают рядом явных недостатков:
1.Биологические системы могут легко быть загрязнены посторонней нежелательной микрофлорой.
2.Целевой продукт, синтезируемый биологическим способом, присутствует в довольно сложной смеси, что обусловливает необходимость разделения его от примеси ненужных веществ.
3.Биотехнологические производства требуют больших количеств воды, которую в итоге необходимо удалять, сбрасывая в окружающую среду.
27
4. Биопроцессы обычно идут медленнее в сравнении со стандартными химическими процессами.
Для каждого биотехнологического процесса должна быть разработана подходящая схема, а сам процесс должен постоянно наблюдаться и тщательно контролироваться. Для большинства практических биотехнологических процессов такими системами являются ферменторы или биореакторы, которые обеспечивают необходимые физические условия, способствующие наилучшему взаимодействию катализатора со средой и поставляемым материалом. Биореакторы варьируют от простых сосудов до весьма сложных систем с различным уровнем компьютерного оснащения.
Биореакторы изготавливаются в двух вариантах или типах. Первый тип для нестерильных систем, когда нет абсолютной необходимости оперировать с чистыми культурами микроорганизмов (например, ферментация при пивоварении, производство пекарских дрожжей и т. п.). Биореакторы второго типа предназначены для асептических процессов, обычно используемых в производстве таких соединений как, антибиотики, аминокислоты, полисахариды и одноклеточный бактериальный белок. В реакторах такого типа все посторонние микроорганизмы должны быть исключены, что, естественно, связано со значительными сложностями при их конструировании и разработке самого биотехнологического процесса.
Основное требование к биореакторам любого типа сводится к обеспечению оптимальных условий роста продуцента или накоплению синтезируемого им продукта. Для достижения указанных целей необходимо разрабатывать технологию, призванную оптимизировать процесс, а именно: использовать подходящий источник энергии, набор питательных веществ должен соответствовать питательным потребностям организма-продуцента, из ростовой среды должны быть удалены соединения, ингибирующие его жизнедеятельность, должна быть подобрана соответствующая посевная доза и, наконец, обеспечены все остальные требуемые физико-химические условия. Экономически рентабельные процессы в своей основе весьма сходны, независимо от избранного продуцента, используемой среды и образуемого продукта. Главная задача – получение максимального количества клеток с одинаковыми свойствами при их выращивании в определенных тщательно контролируемых условиях. Фактически один и тот же биореактор (лишь с небольшими изменениями) может быть использован
28
для производства ферментов, антибиотиков, органических кислот или одноклеточного белка.
Среды, предназначаемые для ферментационных процессов
Превалирующим компонентом всех (или почти всех) биотехнологических процессов является вода. В лабораторных условиях можно легко определить специфические потребности любого конкретного организма и затем (с известной долей приближения) экстраполировать на производственный уровень.
Если процесс крупномасштабный, то важным моментом будет доступность субстрата для культивирования (наличие его в требуемых количествах, стабильность, восполняемость, легкость в обращении и сохранении). Стоимость материалов является важным фактором, поскольку внедрение любого биотехнологического процесса в значительной степени зависит от его стоимости по сравнению с существующими методами производства этого же продукта. Неотъемлемым фактором является здоровье работников, особенно при манипуляциях с порошковыми материалами.
Приготовление питательных сред для ферментационных процессов обычно рассматривается как мало интересная часть общей задачи, но фактически оно является краеугольным камнем, обеспечивающим успех всех последующих этапов. Среды неподходящего состава обусловят низкий уровень ростовых процессов и, следовательно, низкий уровень выхода целевого продукта.
Биореакторы
Биотехнологические процессы принципиально отличаются от процессов химического синтеза и могут быть двух типов: периодическими
инепрерывными. Специфика биотехнологических процессов состоит в том, что в них участвуют живые клетки, субклеточные структуры или выделенные из клеток ферменты и их комплексы. Это оказывает довольно существенное влияние на процессы массопередачи (обмена веществ между различными фазами – перенос кислорода из газообразной фазы в жидкую) и теплообмена (перераспределение тепловой энергии между взаимодействующими фазами). Поэтому одним из важнейших компонентов биореакторов является система перемешивания, обеспечивающая однородность условий в аппарате, оптимальность массопередачи между фазами реактора, между культуральной жидкостью
иклетками и т. д.
29
Другим существенным различием между биотехнологическими и химическими процессами является необходимость создания аэробных или анаэробных условий, требуемых для культивирования соответствующего организма. Поэтому в определенных случаях необходимо подавать кислород и удалять образующиеся газообразные продукты иного рода, в первую очередь двуокись углерода (СО2).
Системы аэрации зачастую бывают очень сложной конструкции, поскольку они должны обеспечить баланс между расходом О2 и его поступлением в нужных количествах, учитывая тот факт, что потребность
вкислороде не одинакова на различных стадиях культивирования. Крайне важным является обеспечение должного уровня теплообмена
вбиореакторах, поскольку жизнедеятельность и метаболическая активность объектов зависит в значительной степени от колебаний температуры. Поддержание температуры в определенном узком диапазоне диктуется: 1) резким снижением активности ферментов по мере падения температуры и 2) необратимой инактивацией (денатурацией) макромолекул (в первую очередь белков) при ее повышении до критических значений. Температурный оптимум у каждого организма
лежит в определенных пределах. Большинство биотехнологических процессов осуществляется в мезофильных условиях (30–50 0С). С одной стороны, это имеет преимущество, потому что лишь в редких случаях приходится обеспечивать повышенный подогрев реакторов. Однако, с другой стороны, возникает проблема удаления избыточного тепла, выделяющегося при интенсивном росте культивируемых клеток, поэтому биореактор должен быть оснащен эффективной системой охлаждения.
Еще одной серьезной проблемой при культивировании в биореакторах является пенообразование, связанное с необходимостью аэрирования содержимого, в котором постоянно присутствуют поверхностно-активные вещества (ПАВ) продукты распада жиров (мыла) и белки (составные компоненты субстрата например, белки соевой и кукурузной муки и т. п.). Образующийся слой пены опять же, с одной стороны, способствует росту аэробных микроорганизмов, а с другой – сокращает полезный объем реактора и способствует заражению культуры посторонней микрофлорой. Это заставляет интенсивно разрабатывать эффективные системы пеногашения.
Специфическим элементом биореактора является система, обеспечивающая стерильность процесса. Стерилизация осуществляется на разных этапах процесса, как до его начала, так и при осуществлении и после окончания. Иными словами, в биотехнологическом производстве
30