Получившийся супернатант переносили во взвешенную заранее охлажденную центрифужную пробирку (m1). Определяли массу пробирки с супернатантом (m2). Производили нейтрализацию хлорной кислоты 69% раствором углекислого калия (К2СО3), доводя рН до 7,0 (рН определяли при помощи универсальной индикаторной бумаги). Определяли массу пробирок с измененной рН (m3).
Для осаждения перхлоратов калия пробирку оставляли на холоде на 10 минут, затем центрифугировали при 3000 g 5 минут. Надосадочную жидкость сливали в чистую пробирку. Количественное содержание субстратов в ткани мозга выражалось в мкмолях исследуемого вещества на 1 г влажной ткани (мкмоль/г).
Лабораторная работа №2. Количественное определение глюкозы в ткани мозга и цельной крови экспериментальных животных
Цель работысравнить уровень глюкозы в ткани мозга и цельной крови экспериментальных животных.
Работа №1. Определение глюкозы в головном мозге проводили энзиматическим методом по Кочетову Г.А. (1980).
Принцип метода:
Глюкоза в присутствии АТФ и гексокиназы фосфорилируется в глюкозо-6-фосфат. Добавление глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы вызывает окисление глюкозо-6-фосфата с образованием эквивалентных количеств восстановленной формы НАДФ. Количество глюкозы в исследуемой пробе эквивалентно количеству восстановившегося НАДФ.
Глюкоза + АТФ → Глюкозо-6-фосфат + АДФ
Глюкозо-6-фосфат + НАДФ → 6-фосфоглюконат + НАДФН2
Изменение оптической плотности раствора в кювете определяется спектрофотометрически при 340 нм.
Ход определения:
В спектрофотометрическую кювету вносили 2 мл 0,2М Трис-буфера (рН 7,0), 0,75 мл 0,017М MgCl2, 0,1 мл 5 мМ НАДФ, 0,05 мл глюкозо-6- фосфатдегидрогеназы (0,4МЕ/мин), 0,09 мл 0,08 М АТФ (рН 7,0). Добавляли 0,1 мл исследуемого образца (тканевого экстракта), перемешивали и измеряли оптическую плотность (Е1) при длине волны 340 нм. Затем
11
добавляли 0,1 мл гексокиназы (0,4МЕ/мин), перемешивали и оставляли на 10 минут при комнатной температуре, затем снова измеряли оптическую плотность (Е2).
Расчет концентрации:
Mглю = ∆E* V * K/6,22; K = (mo + 3,3)*(m3-m1)/mo-(m2-m1); где
М - концентрация субстрата в мкмоль/г влажной ткани;
∆E - разница экстинкции от начала и до полного окончания реакции;
V - объём пробы, мл;
6,22 – коэффициент микромолярной экстинкции восстановленной формы пиридиннуклеотидов;
К – коэффициент разведения по отношению к 1 г ткани;
mo - объём ткани для анализа,
m1 - масса стеклянной пробирки,
m2 - масса пробирки с фильтратом,
m3 - масса пробирки после нейтрализации.
Работа №2. Определение глюкозы в цельной крови проводили энзиматическим колориметрическим методом с депротеинизацией с использованием диагностических наборов фирмы «Vital» (страна производитель - Россия).
Принцип метода:
При окислении β-D-глюкозы кислородом воздуха под действием глюкозооксидазы образуется эквимолярное количество перекиси водорода. Под действием пероксидазы перекись водорода окисляет хромогенные субстраты с образованием окрашенного продукта, который регистрируется при длине волны 510 нм. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации глюкозы в пробе.
Сделать вывод о разнице концентраций глюкозы в ткани мозга и цельной крови животного.
12
Тема № 2. Отличительные особенности метаболизма глюкозы в нейронах и глиальных клетках
Масса головного мозга взрослого человека составляет около 2 % массы тела, доля потребления поступающего в организм кислорода достигает 20−25 %. Установлены существенные различия в потреблении кислорода разными типами клеток мозга.
Всреднем потребление кислорода нейронами протекает в 4−5 раз активнее, чем глиальными клетками. Установлены также различия в интенсивности протекания окислительных процессов в отдельных компартментах одного и того же нейрона: больше кислорода потребляют структуры, локализованные в области перикариона и в синаптических окончаниях.
Вэндотелиальных клетках сосудов, астроцитах работает в широких пределах концентрации глюкозы в крови (2,75−16,50 мкмоль/мл) активный транспортер ГЛЮТ1. Количество этого белка-переносчика увеличивается с возрастом параллельно усилению функциональной активности мозга.
Мутации гена, кодирующего глюкозный транспортер ГЛЮТ1, приводят к развитию тяжелый форм инфантильной эпилепсии.
Астроциты и нейроны сообщаются друг с другом, объединяясь в комплекс, «перерабатывающий» глюкозу. Астроциты первыми захватывают глюкозу, которую им поставляет GLUT1. Транспорт астроцитами нейротрансмиттеров и глюкозы определяет состав экстрацеллюлярной жидкости, омывающей нейроны. Они прямым образом влияют на электрическую активность нейронов и на их чувствительность к глюкозе.
Особенностью гликолиза нейронов является подавленная активность фермента фосфоглюкокиназа. Этот фермент катализирует необратимую (с
гидролизом АТФ) реакцию фосфорилирования фруктозы-6-фосфата до фруктозы-1,6-бифосфата. Образование фруктозы-1,6-бифосфата – это committed step на метаболической развилке между пируватом и пентозо-
фосфатным путём.
13
Получаем, что нейроны функционально блокируют образование пирувата из глюкозы, а вместо этого пускают глюкозу через пентозо-
фосфатный путь на пуриновый метаболизм и нахождение в восстановленном состоянии.
Напротив, астроциты окисляют глюкозу и удовлетворяют энергетический дефицит нейронов в форме молочной кислоты, которая может «перемещаться» в нейроны cell-to-cell. Восстановление пирувата до лактата осуществяет изомер лактат дегидогеназы (LDH-5), который доминирует в астроцитах, а в нейронах доминирует изомер фермента (LDH-
1), который связан в большей степени с утилизацией лактата и образованием пирувата и окислением его в дальнейшем в цикле Кребса.
Поступление глюкозы в мозг и ее потребление клетками глии впрямую зависит от активности нейронов. Глюкоза необходима не только для того,
чтобы обеспечить энергетические потребности, но и для синтеза нейромедиаторов, например глицина, глутаминовой кислоты и гаммааминомасляной кислоты (ГАМК).
Астроциты группируются около синаптических контактов, где располагаются рецепторы. Глутамат стимулирует захват глюкозы астроцитами, в котором участвуют транспортные белки, специфические к глутамату. Глутамат-опосредованное возбуждение снижает аффинитивность глюкозе GLUT3 (нейроны) и повышает аффинитивность глюкозе GLUT1 (астроциты). Глиоциты быстро забирают глутамат после его высвобождения из синапсов и работают благодаря электрохимическому градиенту Na+.
Натрий-зависимый захват глутамата астроцитами запускает каскад молекулярных событий, в котором участвует Na+/K+-ATФаза
(энергозависимый процесс). Внутри клеток глюкоза гликолитически расщепляется и образуется лактат, который высвобождается из астроцитов.
На перенос одной молекулы глутамата требуется три атома натрия, при этом входит одна молекула глюкозы, две молекулы АТФ синтезируются в
результате анаэробного гликолиза и высвобождаются две молекулы лактата.
14
В астроците одна молекула АТФ расходуется на один оборот мембранной протоновой помпы, а вторая потребляется при превращении глутамата в глутамин ферментом глутаминсинтетазой. Показано, что даже в аэробных условиях лактат – предпочтительный энергетический субстрат, который используют нейроны. В присутствии кислорода лактат превращается в пируват, который поступает в митохондрию и в цикл трикарбоновых кислот
(ацетат). При сгорании одной молекулы лактата генерируется 17 молекул АТФ. Это означает, что при активации мозг временно прогоняет глюкозу через астроциты, где проходит гликолиз, а затем окисляет лактат в нейронах с использованием кислорода. Захват глюкозы стимулируется увеличением активности нейронов.
Астроциты забирают глутамат из синаптической щели, он метаболизирует в глутамин (глутаминсинтетаза). Затем они отдают глутамин нейронам, которые вновь делают из него глутамат или ГАМК (фермент глутаматдекарбоксилаза). Переносчик глутамата GLT1 экспрессируется преимущественно в астроцитах, а глиальный высокоаффинный переносчик глутамата (GLAST) – как в астроцитах, так и в других клетках глии.
Накопление глутамата в экстрацеллюлярном пространстве делает его токсичным. Контроль за экстрацеллюлярными концентрациями глутамата и ГАМК – одна из фундаментальных функций клеток глии. Баланс концентраций этих двух нейротрансмиттеров – решающий, он характеризует активность метаболических процессов.
Вопросы для самоконтроля:
1.Гликолитическое расщепление глюкозы в нейронах и клетках глии. Показать особенности с помощью уравнений реакций.
2.Лактатный шаттл астроцитов.
3.Гексокиназная реакция. Ее значение в окислении глюкозы головным мозгом. Ингибиторы и активаторы данной реакции.
4.Нарисовать схему взаимопревращения глутамат-глутамин и
обосновать участие в этом процессе молекулы глюкозы.
15