РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК
Институт Биоорганической Химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова
ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание учёной степени доктора биологических наук
Полногеномные подходы к функциональному анализу повторяющихся элементов
03.00.03 - Молекулярная биология
БУЗДИН АНТОН АЛЕКСАНДРОВИЧ
Официальные оппоненты:
Доктор биол. наук М.Б. Евгеньев
Доктор биол. наук К.А.Лукьянов
Член-корреспондент РАН, доктор биол. наук профессор Н.В.Томилин
Научный консультант:
Академик РАН, доктор биол. наук профессор Свердлов Е.Д.
Москва - 2008
Содержание
Литературный обзор:
Потенциал и границы применения гибридизации нуклеиновых кислот
1.1 Введение
1.2 Клонирование дифференциальных последовательностей: вычитающая гибридизация
1.2.1 Появление метода
1.2.2 Вычитающая гибридизация, основанная на ПЦР амплификации
1.2.3 Первый впечатляющий успех: репрезентативный дифференциальный анализ (RDA)
1.2.4 Дальнейшие усовершенствования: супрессионная вычитающая гибридизация (SSH), эффект супрессии ПЦР и нормализация библиотек кДНК
1.2.5 Другие перспективные подходы к вычитающей гибридизации
1.3 Поиск общих последовательностей: метод клонирования совпадений
1.4 Гибридизация в растворе для поиска геномных полиморфных участков
1.5 Заключение
Селективная супрессия ПЦР и наиболее популярные приложения этого метода
2.1 Введение
2.2 Принцип селективной супрессии ПЦР (ССП)
2.3 Подготовка образцов ДНК, содержащих инвертированные концевые повторы
2.4 Стратегия применения различных вариантов ССП
2.5 Семейство методов, основанных на ССП
2.5.1 Создание библиотек кДНК с использованием небольших количеств биологического материала
2.5.2 Детекция дифференциально экспрессирующихся генов
2.5.3 Поиск 5'- и 3'-концевых фрагментов кДНК
2.5.4 Поиск промоторных участков и модификация метода «прогулки по хромосоме»
2.5.5 Клонирование in vitro
2.5.6 Мультиплексная ПЦР
Использование сковородоподобных олигонуклеотидов как гибридизационных проб
3.1 Введение
3.2 «Молекулярные беконы»
3.3 Сковороподобные ДНК-зонды для микрочиповой гибридизации
3.4 Заключение
Нормализация библиотек кДНК
4.1 Введение
4.1.1 Для чего нужна нормализация библиотек кДНК
4.1.2 Оценка эффективности нормализации
4.2 Основные подходы к нормализации библиотек кДНК
4.2.1 Создание нормализованных библиотек, обогащённых полноразмерными кДНК, с использованием дуплекс-специфичной нуклеазы (ДСН-нормализация)
Клонирование совпадений: эффективный метод экспериментального выделения общих последовательностей
5.1 Введение
5.2 Селекция гетеродуплексов на стадии клонирования
5.3 Физическое разделение гибридных молекул
5.4 Подходы, основанные на ПЦР
5.5 Краткое заключение
Гибридизация ДНК в растворе для детектирования мутаций
6.1 Введение
6.2 Химические методы
6.3 Энзиматические методы
6.3.1 Нуклеазное сканирование мутаций
6.3.2 Подходы, основанные на аллель-специфической ПЦР
6.3.3 Другие энзиматические подходы для сканирования мутаций
6.4 Физические методы
Подходы к повышению специфичности гибридизации нуклеиновых кислот
7.1 Введение
7.2 Улучшение параметров кинетики гибридизации
7.2.1 Упрощение гибридизационных смесей
7.2.2 Химические модификации
7.3 Ужесточение требований к селекции совершенных дуплексов
Практическая часть:
1. Методы идентификации новых копий геномных повторов
1.1 Введение
1.2 Метод TGDA: вычитающая гибридизация участков, фланкирующих геномные повторы
1.3 Метод Diffir: дифференциальная гибридизация фланков геномных повторов на фильтре
1.4 Приложение методов TGDA и Diffir для молекулярной генетики человека
1.4.1 Идентификация человек-специфичных инсерций эндогенных ретровирусов
1.4.2 Идентификация человек-специфичных вставок ретроэлементов L1
1.4.3 Новое семейство химерных ретроэлементов эукариот
2. Анализ транскрипционной активности геномных повторов
2.1 Введение
2.2 Метод GREM: полногеномный поиск промоторно-активных повторов
2.3 Приложение GREM для поиска промоторно-активных эндогенных ретровирусов, специфичных для ДНК человека
2.4 Антисмысловая регуляция экспрессии генов молекулами РНК, транскрибируемыми с промоторов человек-специфичных эндогенных ретровирусов
3. Повышение специфичности гибридизации в растворе
3.1 Введение
3.2 Метод MDR: селективная деградация неправильно спаренных гетеродуплексов
3.3 Приложение MDR для поиска эволюционно консервативных последовательностей в геномах человека и обезьян
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
ОБЩИХ СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ДИССЕРТАНТА
ВЫВОДЫ
Список цитируемых литературных источников
БЛАГОДАРНОСТИ
Эта диссертационная работа посвящена структурно-функциональному анализу мобильных элементов эукариот. Основная часть результатов была получена при применении новых методов, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот в растворе. Литературный обзор посвящён именно описанию существующих на настоящий момент экспериментальных подходов к крупномасштабному анализу генома и транскриптома. Биология мобильных элементов рассматривается в литературном обзоре лишь вскользь, поскольку эта тема подробно описывалась в обзоре к диссертации автора на соискание учёной степени кандидата биологических наук. Два фактора: нежелание повторяться, а также то, что методическим подходам, даже новым и оригинальным, как правило, уделяется до обидного мало места в печатных трудах, и сформировали позицию автора относительно структуры настоящей диссертационной работы.
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1. Потенциал и границы применения гибридизации нуклеиновых кислот
Различные экспериментальные подходы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот, такие как гибридизация микрочипов, конкурентная геномная и Саузерн/Нозерн блот гибридизация, стали весьма популярны среди научного сообщества и используются в настоящее время повсеместно. Однако же, представляется недооценённым потенциал ряда родственных экспериментальных методов, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот в растворе. К таким методам относятся вычитающая гибридизация, которая позволяет эффективно находить различия в образцах геномной ДНК или кДНК; метод клонирования общих последовательностей (англ. coincidence cloning), который, напротив, позволяет идентифицировать последовательности, присутствующие во всех сравниваемых образцах; нормализация кДНК, которая используется для выравнивания концентраций часто- и редко представленных транскриптов в библиотеках кДНК; метод, названный TILLING, широко применимый для исследований в области обратной генетики. Наконец, некоторые методы направлены на крупномасштабный поиск полиморфных участков ДНК, включая выявление однонуклеотидных полиморфизмов. Литературный обзор настоящей диссертационной работы посвящён этим и другим недавним достижениям в области гибридизации нуклеиновых кислот, включая попытки повышения её специфичности. В первой, вводной, главе, автор старается дать краткую характеристику нынешнему уровню развития технологии гибридизации нуклеиновых кислот в растворе, а также определить основные принципы и области применения основанных на ней методов. В главе также будут обсуждаться преимущества и недостатки этих методов.
1.1 Введение
Уотсон-Криковская гибридизация комплементарных последовательностей нуклеиновых кислот - это один из самых важных фундаментальных процессов, необходимый как для узнавания на молекулярном уровне in vivo (1), так и для выделения и анализа нуклеиновых кислот in vitro (2). Использование экспериментальных подходов, основывающихся на гибридизации ДНК в растворе, имеет ряд преимуществ для многих приложений, начиная от конструирования репрезентативных библиотек кДНК для секвенирования пулов EST, и заканчивая идентификацией эволюционно консервативных последовательностей, дифференциально экспрессирующихся генов и геномных делеций. Уникальные характеристики многих таких методов делают их сильными конкурентами таких широко известных и вошедших в моду подходов, как микрочиповая и конкурентная геномная гибридизации. В качестве примера можно привести следующие методы: вычитающая гибридизация позволяет находить различия в образцах кДНК или геномной ДНК; метод клонирования совпадающих последовательностей (coincidence cloning), напротив, эффективен для поиска общих последовательностей в сравниваемых образцах; нормализация кДНК успешно используется для выравнивания содержания часто- и редко встречающихся последовательностей в библиотеках кДНК, что особенно важно для создания репрезентативных библиотек EST (англ. expressed sequence tag). Более того, некоторые методы используются для крупномасштабного поиска полиморфных локусов, включая идентификацию однонуклеотидных полиморфизмов.
Гибридизация нуклеиновых кислот в растворе имеет ряд преимуществ общего характера перед гибридизацией с нуклеиновыми кислотами, иммобилизованными на твёрдом носителе: более быструю кинетику гибридизации, лучшую дискриминацию совершенных дуплексов и возможность использовать полученные дуплексы для дальнейшей ПЦР амплификации и клонирования. Среди методов гибридизации в растворе, вычитающая гибридизация, безусловно, на настоящий момент является наиболее популярной техникой. Анализ дифференциально экспрессирующихся генов в постгеномную эру требует масштабного скрининга и включает в себя как анализ транскриптома и протеома, так и расширенный поиск функциональных полиморфизмов среди популяций. Основными подходами, используемыми для достижения этих целей, являются секвенирование по Сэнгеру и ДНК-чипы, применяемые как для качественных, так и для количественных измерений (3). Вместе с тем, нельзя не признать ряд существенных недостатков, которыми обладают многие популярные подходы, основанные на технологии микрочипов:
Анализ ограничен количеством кДНК или синтетических олигонуклеотидов, нанесённых на чип. Это количество, как правило, существенно ниже, чем общее количество генов у исследуемых организмов. Таким образов, многие гены избегают анализа в подобных системах.
Даже «полнотранскриптомные» ДНК-чипы в их нынешнем виде слабо дискриминируют различные сплайс-формы мРНК.
Экспрессия генов, транскрибируемых на низком уровне, не может быть детектирована с использованием стандартных микрочиповых систем.
Чипы, созданные на основе нанесенных на твёрдый носитель кДНК, не позволяют дискриминировать различных индивидуальных представителей многих генных семейств, а также многие транскрипты, содержащие в своём составе геномные повторы.
Наконец, микрочипы не содержат большинства регуляторных антисмысловых РНК и не могут быть использованы для масштабных исследаваний регуляции экспрессии генов по пути РНК интерференции.
Однако же, многие из вышеперечисленных недостатков могут быть исправлены при подборе или же разработке специфических вариантов технологии микрочипов.
Впрочем, наиболее важный минус закрытых систем, таких как микрочипы, сохраняется: все они требуют предварительной информации по геномной и транскриптомной последовательностям для обнаружения, например, дифференциально экспрессирующихся транскриптов.
Открытые системы обладают большей «подвижностью» в детекции новых последовательностей с неизвестной структурой и/или функциональным статусом. Различия в экспрессии генов между двумя образцами могут быть найдены как результат прямого сравнения двух образцов, без предварительного упрощения транскриптомов в угоду той или иной теории, которой придерживается исследователь или же основываясь на которой был разработан микрочип. К таким методам прямого сравнения относятся методы дифференциального дисплея (4), дифференциального клонирования (5), а также комбинация этих методов (6, 7). Эти подходы успешно применялись для поиска генов, дифференциально экспрессирующихся в двух сравниваемых образцах. Впрочем, следует упомянуть и недостаток упомянутых методов: они эффективно применимы лишь для анализа генов, экспрессирующихся на высоком уровне и/или показывающих значительные различия в уровнях экспрессии в сравниваемых образцах. При этом эффективность обнаружения дифференциальных слабо экспрессируемых транскриптов крайне низка (8). Эта проблема становится неразрешимой, когда разница в экспрессии таких «редких» транскриптов между образцами также мала. Необходимо заметить, что многие гены, экспрессируемые на низком уровне, играют важнейшие роли в установлении и поддержании различных фенотипических признаков, и их всесторонний анализ необходим для понимания целостной картины механистических изменений, происходящих в клетке. Основным преимуществом вычитающей гибридизации является возможность поиска дифференциально экспрессирующихся генов вне зависимости от уровня их транскрипции, и при отсутствии предварительных данных об их первичной структуре. Помимо получения дифференциальных библиотек кДНК, вычитающая гибридизация также чрезвычайно полезна для поиска различий в геномных ДНК (9-13).
1.2 Клонирование дифференциальных последовательностей: вычитающая гибридизация
1.2.1 Появление метода
Вычитающая гибридизация (ВГ) была впервые использована Баутцем и Рейлли в 1966 г. для очистки мРНК фага T4 (14). Позднее, в нескольких исследовательских группах использовались варианты этой техники, как для клонирования кДНК, полученных из мРНК сравниваемых образцов (вычитание кДНК), так и для выявления крупных делеций в геномной ДНК (геномное вычитание). Техника ВГ получила «второе дыхание» в 1984 г., когда Палмер и Ламар применили ВГ для создания рекомбинантных библиотек геномной ДНК мыши, обогащённых последовательностями, относящимися к У хромосоме (15). Начиная с этого момента, техника вычитающй гибридизации начала быстро развиваться и на настоящий момент значительно эволюционировала, став одним из наиболее важных и эффективных подходов молекулярной биологии. Этот поистине универсальный метод используется для весьма различных экспериментальных задач, таких как клонирование и характеристика новых генов, поиск болезнь-, организм- и ткане-специфических транскриптов, идентификация генов, дифференциально экспрессирующихся на различных стадиях эмбрионального развития, прогрессии рака, регенерации, для поиска генов, регулируемых в ответ на внешнюю или внутреннюю стимуляцию, и так далее (16, 17). Техника ВГ эффективна для полногеномного сравнения бактериальной ДНК (13), для выделения видо-специфических геномных локусов (18, 19) и полиморфных маркёров как в эукариотических, так и в прокариотических геномах (13, 20). Кроме того, ВГ использовалась для субклонирования ДНК из дрожжевых искусственных хромосом (YAC) в более мелкие векторы (21), для картирования геномных перестроек, ассоциированных с раком или хромосомными аномалиями, а также для заполнения протяжённых брешей геномной последовательности в крупномасштабных проектах по секвенированию геномов (22).
Однако же, важность ВГ остаётся на настоящий момент недооцененной. В этом разделе автор постарался описать все основные подходы, основанные на вычитании нуклеиновых кислот. Как было упомянуто, ВГ стала популярна начиная с 1984 г., когда Палмер и Ламар предложили простую идею разделения гибридных молекул ДНК. Двуцепочечные гомогибриды так называемой «трейсерной», или «тестерной» ДНК (образец, содержащий дифференциальные последовательности, которые надо найти) отделялись от гетерогибридов трейсер-драйвер и гомогибридов драйвер-драйвер («драйвер» - это контрольный образец, с которым сравнивают трейсер). Задачей ВГ является выделение фракции трейсер-специфичной ДНК, отсутствующей в драйвере. Предложенная идея заключалась в том, что трейсер и драйвер должны иметь различающиеся последовательности на концах (15). Авторы хотели создать рекомбинантную библиотеку ДНК мыши, обогащённую последовательностями, относящимися к У хромосоме (Рис. 1.1). ДНК самки мыши (драйвер) была фрагментирована ультразвуком, тогда как ДНК самца (трейсер) обработали эндонуклеазой рестрикции MboI. ДНК трейсера смешали со 100-кратным весовым избытком драйвера, денатурировали и ренатурировали. При этом только реассоцировавшие гомодуплексы трейсер-трейсер имели липкие концы с обеих сторон и могли быть лигированы в плазмидный вектор pBR322, расщеплённый эндонуклеазой рестрикции BamHI.