Другая модификация RDA использовалась для картирования делеций, произошедших в геномах опухолевых клеток (21). Продукты ВГ раковых и нормальных геномов гибридизовались с упорядоченной библиотекой YAC, что позволило авторам напрямую картировать дифференциальные последовательности и, таким образом, находить делеции, специфичные для раковых клеток (замечу, что в то время полная последовательность генома человека ещё не была опубликована). Позднее, RDA применили для заполнения брешей при секвенировании генома Xilella fastidiosa (22). Фрагменты с уже установленной первичной структурой вычитали из генома Xilella, затем дифференциальные последовательности гибридизовали с полной геномной клонотекой X. fastidiosa, и позитивные клоны (содержащие последовательности с пока не установленной перевичной структурой) секвенировали.
Ещё одним интересным применением ВГ стала техника поиска полиморфизмов длин рестриктных фрагментов (ПДРФ), названная “RFLP subtraction” (64). Сравниваемые образцы геномной ДНК обрабатывали эндонуклеазами рестрикции и поотдельности разделяли на агарозном геле. Затем для трейсера и драйвера вырезались определённые зоны (например, содержащие фрагменты длиной от 100 до 500 п.н.), ДНК элюировали из агарозы и использовали для ВГ. В результате получали ампликоны, обогащённые фрагментами, присутствующими в такой зоне в трейсере, но отсутствующие в аналогичной зоне в драйвере. Техника была эффективна для обнаружения новых ПДРФ, генетических маркёров универсальной применимости. Этот подход был затем значительно улучшен, когда авторы (65) применили ВГ непосредственно в геле. Оба фрагментированных сравниваемых образца, один (драйвер) - в 100-кратном весовом избытке относительно другого (трейсер), наносили на одну и ту же дорожку на геле и разделяли электрофоретически. Гель обрабатывали щелочью для химической денатурации ДНК, а затем нейтрализовали, что позволяло проводить гибридизацию непосредственно в геле. Наконец, гибридизованную ДНК элюировали из геля и амплифицировали с помощью ПЦР для селекции дуплексов трейсер-трейчер. Авторам удалось добиться чрезвычайно высоких значений обогащения по дифференциальным последовательностям, близких к теоретически достижимым. Такой успех может быть объяснён высокими локальными концентрациями фрагментов каждого типа в геле, которые были значительно выше, чем при гибридизации в растворе. К сожалению, этот подход, который мог бы стать превосходной альтернативой наиболее востребованным техникам ВГ, а именно RDA и SSH, является чрезвычайно трудоёмким.
1.2.4 Дальнейшие усовершенствования: супрессионная вычитающая гибридизация (SSH), эффект супрессии ПЦР и нормализация библиотек кДНК
На рисунке 1.3 можно увидеть, что разработка нового метода, названного «супрессионной вычитающей гибридизацией», англ. “suppression subtractive hybridization, SSH” (10, 66), а также появление на рынке соответствующего кита производства фирмы Clontech в 1996 вызвала революцию в использовании ВГ. Техника стала более производительной, воспроизводимой и простой в исполнении. Повышенный интерес к методу сопровождался некоторыми качественными изменениями в динамике цитирования ВГ в литературе: если за период 1984-1991 приблизительно каждая третья статья описывала модификации и улучшения (с точки зрения авторов) техники ВГ, в 1992-1995 - каждая пятая, то в 1998-1999 - каждая десятая, а в 2000-2005 (когда метод SSH стал популярен и соответствующий кит занял достойное место на рынке) - всего лишь каждая 62-я (!). Таким образом, можно говорить о том, что популяризация SSH и RDA в основном вытеснили другие приложения и «отрицательно» сказались на креативности авторов, которые теперь были удовлетворены предлагаемыми модификациями ВГ. Возможно, это означает, что эти методы не могут быть далее улучшены, или же то, что для большинства приложений улучшения этих методов и не требуется: ВГ стала рутинной и воспроизводимой методикой.
Основное преимущество SSH над остальными вариантами ВГ - это значительно уменьшенный фон фальш-позитивных клонов. В других методах этот фон вызывается линейной амплификацией гибридов трейсер-драйвер, что сводится к минимуму при применении SSH (см. более детальное объяснение в Главе 2). Другим преимуществом SSH стала возможность одновременной нормализации библиотек кДНК, которая применяется для выравнивания концентраций различных транскриптов, присутствующих в сравниваемых пулах кДНК. Выравнивание, например, необходимо для того, чтобы избежать дискриминации редкопредставленных транскриптов при вычитании. Нормализация библиотек кДНК может быть использована не только для нужд ВГ, но и, например, для конструирования репрезентативных библиотек EST. Эта независимая группа методов описана в Главе 4.
Оба преимущества техники SSH базируются на так называемом эффекте «ПЦР супрессии» (детальное описание дано в Главе 2). Приблизительно 40-нуклетидные ГЦ-богатые линкеры (называемые супрессионными адапторами) лигируют к фрагментированной двуцепочечной ДНК. Затем ДНК полимераза достраивает вторую цепь адапторов, так что в результатк исходные фрагменты ДНК фланкируются инвертированными ГЦ-богатыми повторами длиной около 40 п.н. Принцип метода заключается в том, что праймеры, комплементарные последовательности супрессионных адапторов, не могут эффективно отжигаться на матрице и инициировать ПЦР сами по себе (Рис. 1.5) благодаря значительно более сильным внутримолекулярным комплементарным взаимодействиям между инвертированными повторами, которые элиминируют сайты, доступные для посадки праймеров в ходе ПЦР. Использование эффекта ПЦР супрессии предотвращает фоновую амплификацию с адаптор-специфических праймеров.
Рисунок 1.5. Принцип эффекта ПЦР супрессии. GC-богатые инвертированные повторы (супрессионные адапторы) спариваются внутримолекулярно, тем самым мешая отжигу более коротких праймеров, специфичых последовательности адаптора. При этом значительно понижается фоновая амплификация при использовании адаптор-специфических праймеров.
На рисунке 1.6 схематично изображена процедура SSH и её приложение для идентификации различий между бактериальными геномами. Сравниваемые ДНК (как трейсер, так и драйвер) расщепляются эндонуклезами рестрикции, затем ДНК трейсера разделяется на две порции (назв. Трейсер А и Трейсер Б), и к порциям лигируются разные супрессионные адапторы. К ДНК драйвера при этом ничего не лигируется. Обе фракции трейсера смешиваются с избытком драйвера, денатурируются и гибридизуются. При последующей ПЦР амплификации с праймерами, комплементарными обоим использованным супрессионным адапторам, экспоненциально амплифицируются только дуплексы Трейсер А/Трейсер Б, обогащённые по последовательностям, специфичным для трейсера (12).
Рисунок 1.6. Схема метода супрессионной вычитающей гибридизации (SSH), применённой для сравнения двух бактериальных геномов. При анализе сложных геномов, как геномы млекопитающих, должны применяться другие подходы.
Обычно SSH используется для сравнения транскриптомов (10), что позволяет создать высококачественные дифференциальные библиотеки кДНК. Частично удалось решить одну из самых основных и общих проблем всех методов анализа кДНК, а именно - проблему потери редко представленных транскриптов в получаемых библиотеках. Метод, разработанный под руководством С.А.Лукьянова для нормализации библиотек кДНК в растворе (Рис. 1.7; см. также Главу 4) позволяет осуществлять простое и эффективное выравнивание концентраций редко- и часто представленных кДНК. К двум порциям фрагментированной двуцепочечной кДНК лигируются два различных супрессионных адаптора, обе порции отдельно денатурируют и оставляют ренатурировать на короткое время. На этой стадии, друг с другом гибридизуются в основном часто представленные последовательности. Затем обе фракции смешивают и оставляют гибридизоваться, уже на длительное время. Те кДНК, которые не сформировали дуплексы во время первой гибридизации, могут прогибридизоваться теперь. Затем концы гибридизованных кДНК достраиваются ДНК полимеразой и проводится их ПЦР амплификация с праймерами, комплементарными использованным супрессионным адапторам (Рис. 1.7). В результате, экспоненциально амплифицируются только те дуплексы, которые были сформированы во время второй, а не первой, гибридизации. Ампликон, таким образом, оказывается обогащён репликами редко представленных транскриптов. Такая стратегия является отличной альтернативой гораздо более сложному подходу (67), основанному на специальном вычитании последовательностей высоко представленных транскриптов из исходных пулов кДНК для обогащения по «редким» кДНК.
Рисунок 1.7. Схема нормализации библиотек кДНК с использованием эффекта ПЦР супрессии. Нормализация приводит к выравниванию концентраций часто- и редко-представленных транскриптов, что необходимо для более высокой представительности библиотек кДНК и для некоторых других приложений как секвенирование библиотек EST.
Хотя количество фоновых фальш-позитивных клонов при использовании SSH, как правило, невелико, было предложено дальнейшее усовершенствование этого метода (68). При помощи метода, названного “Mirror orientation selection (MOS)” (Рис. 1.8), количество недифференциальных клонов уменьшается основываясь на наблюдении, что фон, создающийся реассоциацией не-трейсер-специфичных молекул, появляеся случайным образом, и каждый из типов таких фоновых дуплексов представлен малым числом молекул относительно «правильных» трейсер-специфичных последовательностей. Поскольку продукты SSH несут адапторные последовательности (Рис. 1.8), фланкирующие ДНК трейсера в обеих ориентациях (продукты A и A' на рисунке), то удаление адаптора, денатурация и последующие гибридизация и заполнение концов приведут к появлению фрагментов трейсера, фланкированных последовательностью второго адаптора с обоих концов. При помощи ПЦР, такие фрагменты трейсера могут быть экспоненциально амплифицированы с использованием одного праймера (Рис. 1.8). При этом фоновые фрагменты теряются, поскольку они появляются в SSH-ампликонах случайно и каждый их вид представлен крайне низкими концентрациями (тогда как количество таких видов фоновых последовательностей может быть огромно), и возможность того, что они сформируют гибриды, несущие адапторную последовательность с обеих сторон, в большинстве случаев пренебрежимо мала (Рис. 1.8, правая сторона).
Рисунок 1.8. Схема метода мirror oriented selection (MOS). MOS применяют для уменьшения фона, создаваемого псевдо-селективной амплификацией случайных побочных последовательностей. MOS был признан эффективным как для сравнения кДНК, так и сложных геномных ДНК.
Кроме того, SSH может быть использована в комбинации с дифференциальным дисплеем (6) и микрочиповой гибридизацией (7). Последний подход представляется весьма перспективным, так как позволяет получать интегральную картину пространственно-временной дифференциальной экспрессии генов. При этом важно заметить, что непосредственное использование гибридизации с микрочипами как правило дискриминирует редкопредставленные транскрипты, тогда как предварительная процедура SSH, особенно со стадией нормализации кДНК, может значительно повысить как чувствительность метода, так и воспроизводимость результатов.
1.2.5 Другие перспективные подходы к вычитающей гибридизации
В предыдущих разделах были описаны две наиболее популярные экспериментальные техники, основывающиеся на ВГ, которые делают вычитающую гибридизацию одним из наиболее эффективных, своевременных и универсальных подходов молекулярной биологии, подобно дифференциальному дисплею, масштабному секвенированию геномов, секвенированию библиотек EST и серийному анализу генной экспрессии (69). Поскольку количество опубликованных работ, использующих ВГ, возрастает даже несмотря на отсутствие серьёзных популяризованных усовершенствований в её методологии в течение последних 6 лет, потенциал вычитающей гибридизации остаётся высоким. В этом разделе будут рассмотрены некоторые недавние оригинальные и перспективные методы, основанные на ВГ. Новый подход, названный “covalently hybridized subtraction (CHS)”, использует ковалентную сшивку трейсера и драйвера после гибридизации (70). Для этого ДНК драйвера химически модифицируется таким образом, чтобы все цепи ДНК, загибридизовавшиеся с драйвером, оказались ковалентно связаны с ним и не могли быть амплифицированы в ходе ПЦР, в отличие от гибридов трейсер-трейсер. Другой интересный подход был использован для улучшения техники RDA. Он основан на защите 3' концов ДНК трейсера с использованием альфа-тио-дезоксирибонуклеотидов (71). После гибридизации с немодифицированным драйвером, получившаяся смесь обрабатывается нуклеазами ExoIII, которая отщепляет незащищённые 3' концевые нуклеотиды, и Mung Bean, которая расщепляет участки одноцепочечной ДНК. После такой обработки, в растворе остаются лишь гибриды трейсер-трейсер, которые затем амплифицируют в ходе ПЦР, клонируют и секвенируют.
Наконец, новая техника, названная “primer extension enrichment reaction (PEER)” (72), основана на оригинальном принципе использования коротких фрагментов трейсера для праймирования реакции удлинения праймера на матрице ДНК драйвера. Для этого двуцепочечную ДНК трейсера фрагментируют на небольшие фрагменты при помощи расщепления эндонуклеазами, а затем лигируют к ним якорные последовательности специальных адапторов. 3' конец адаптора содержит сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции класса IIS. Фрагменты затем расщепляют ферментом класса IIS Mme I с тем, чтобы создать пул олигонуклеотидов с уникальным 3'-концом, пришедшим из последовательности трейсера, и адапторным 5'-концом. Такие помеченные адапторной последовательностью олигонуклеотиды отжигаются на ДНК драйвера и удлиняются в присутствии биотинилированных дидезоксинуклеотидтрифосфатов. Последние блокируют дальнейшую достройку и позволяют удалить биотинилированные молекулы из раствора при помощи магнитных гранул, конъюгированных со стрептавидином. Таким образом, праймеры, комплементарные последовательности драйвера, блокируются и удаляются из раствора, где остаются лишь праймеры с уникальными для трейсера последовательностями. В присутствии исходной полноразмерной ДНК трейсера, эти олигонуклеотиды могут праймировать реакцию достройки фрагментов, уникальных для трейсера. На этой стадии праймеры с якорными адапторными последовательностями достраиваются до полноразмерных матриц ДНК, которые могут быть далее амплифицированы с использованием адапторных праймеров. Получившиеся фрагменты клонируют и секвенируют. Авторы показали, что по крайней мере для некоторых приложений метод PEER был значительно более чувствительным и эффективным, чем другие варианты ВГ, включая SSH.