Рисунок 1.1. Схема вычитающей гибридизации геномной ДНК, предложенная Палмером и Ламаром, основана на клонировании гибридов трейсер-трейсер при помощи уникальных рестриктных сайтов.
Вскоре этот принцип был успешно применён для клонирования фрагментов ДНК человека, делетированных у пациентов с миотонической дистрофией Дюшенна (23). Одновременно, другая исследовательская группа использовала похожий подход для поиска матричных РНК, различающих анализируемые образцы (24, 25), специфичных для определённого типа клеток, тканей или же организма (Рис. 1.2). На матрице поли(A)+ фракции РНК трейсера, синтезировали первые цепи кДНК, затем исходную РНК расщепляли в щелочных условиях, так что в растворе оставались только первые цепи кДНК, комплементарные исходной мРНК трейсера. Трейсер смешивали с драйвером, взятым в 100-кратном или большем весовом избытке. Драйвер являлся фракцией поли (A)+ РНК из другого образца. В получившейся смеси, фрагменты трейсера либо гибридизовались с избытком комплементарных цепей драйвера, либо же оставались в форме одноцепочечной ДНК. Эта последняя одноцепочечная фракция, обогащённая трейсер-специфичными последовательностями, очищалась от драйвера и гибридов трейсер-драйвер на гидроксиапатитовой колонке (специфично связывает двуцепочечные нуклеиновые кислоты). На матрице очищенного одноцепочечного трейсера синтезировали вторую цепь кДНК и лигировали двуцепочечную кДНК либо в экспрессионный вектор (если требовались дополнительные раунды вычитания), либо в вектор для клонирования (24, 25). Для повышения скорости гибридизации, к гибридизационной смеси могли быть добавлены химические акселераторы, например фенол (26).
Рисунок 1.2. Схема вычитания кДНК/мРНК, использующая щелочную деградацию РНК на стадии 2.
Однако же, этот подход не завоевал популярности, в первую очередь из-за трёх серьёзных ограничений: (1) требовались большие количества очищенной мРНК, (2) технические манипуляции были чрезвычайно трудоёмки и (3) деградация РНК создавала проблемы на всех стадиях работы. Позднее, первая из этих проблем была решена при клонировании кДНК трейсера и драйвера в специальные одно- или двуцепочечные экспрессионные векторы. РНК нарабатывалась в E. coli, что давало возможность получения больших количеств для гибридизации (27-29). Третий барьер был частично снят, когда мРНК драйвера была заменена на двуцепочечную кДНК (использование первых цепей одноцепочечной кДНК было чрезмерно дорого, а двуцепочечная кДНК могла быть наработана в E. coli). Впрочем, при этом возникла новая проблема: как разделять дуплексы трейсер-трейсер от дуплексов драйвер-драйвер?
В 1986 Велхер с соавторами применили для вычитания биотин-стрептавидиновую систему (30): биотинилированные праймеры использовались для синтеза кДНК драйвера, и продукты вычитания инкубировались конъюгированные со стрептавидином медные гранулы. В результате, в растворе оставались дуплексы трейсер-трейсер, тогда как гранулы связывали остальные продукты гибридизации, кроме одноцепочечного трейсера. Этот метод разделения продуктов вычитания стал достаточно популярным (при этом модифицировались отдельные детали). В 1993, магнитные гранулы заменили медные гранулы в качестве твердофазного носителя для конъюгированного стрептавидина при очистке гибридов трейсер-трейсер (31, 32).
Подводя итог, можно сказать, что ранние методы вычитания кДНК обычно использовали один или два раунда гибридизации и использовали (-) мРНК как драйвер и (+) кДНК как трейсер. При этом наработка (-) мРНК в больших количествах была во многих случаях затруднительна. Степень обогащения трейсер-специфичными последовательностями ограничена соотношением драйвер:трейсер, и за один раунд вычитания произойдёт адекватное обогащение только тех молекул, которые редки в (-) популяции и часто представлены в (+) популяции. Последовательности, которые представлены на среднем и низком уровнях, либо же те, содержание которых различается в трейсере и драйвере не очень сильно (в единицы раз), оказываются недопредставлены в получающихся вычтенных библиотеках кДНК. Более того, количество кДНК, остающееся после гибридизации, может быть очень мало, что часто создаёт проблемы при клонировании продуктов ВГ.
1.2.2 Вычитающая гибридизация, основанная на ПЦР амплификации
Невзирая на ряд вышеупомянутых модификаций, вычитающая гибридизация оставалась чрезвычайно трудоёмким процессом: за период с 1984 по 1989 годы, использование ВГ было описано лишь в 29 исследовательских статьях (Рис. 1.3). Введение в протокол ВГ полимеразной цепной реакции (ПЦР) сделало ВГ простой, недорогой и широко используемой техникой. Теперь исследователь мог получать большие количества ДНК трейсера и драйвера простым и недорогим способом из ничтожно малого количества исходного материала. Более того, использование ПЦР решило проблему клонирования продуктов вычитания (33-35). Поэтому, начиная с 1990 ПЦР была включена практически во все протоколы вычитания, что сказалось на повышении интереса научного сообщества к методу ВГ: количество публикуемых приложений ВГ в год растёт в 3-4 раза (Рис. 1.3).
Рисунок 1.3. Динамика цитирования принципа вычитающей гибридизации в научной литературе. Публикации в журналах, реферируемых в базе данных MedLine, анализировались при помощи сервера PubMed at NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Даётся интегральная картина из 16 публикаций для периода с 1984 по 1987.
ПЦР также предоставила возможность решить ещё одну важную проблему: без ПЦР представлялось невозможным проводить эффективное вычитание редких транскриптов, так как их концентрации были слишком малы и скорость реассоциации в ходе ВГ была для них пренебрежимо малой; поэтому такие транскрипты избегали анализа. Применение ПЦР позволило получать неограниченно большие количества ДНК для гибридизации, что дало возможность детектировать в том числе и редкие транскрипты (33-37). Помимо анализа экспрессии генов, начиная с 1991 ВГ стала использоваться для поиска дифференциальных последовательностей в бактериальных геномах (38), что является одним из наиболее важных приложений ВГ и поныне: идентификация различий в геномной ДНК между вирулентными и невирулентными штаммами, болезнетворными видами бактерий и безвредными родственными видами, является крайне важной как для создания новых диагностических маркеров, так и для поиска бактериальных генов - мишеней разработки новых лекарств (38, 39).
Однако же, эффективность вычитания геномной ДНК в значительной мере зависит от сложности сравниваемых ДНК, что было показано как экспериментально (40, 41), так и предсказано исходя из математических моделей вычитающей гибридизации (42-45). При размере генома свыше 5x108 пн (сложность, сравнимая с геномами арабидопсиса и дрозофилы), кинетика гибридизации начинает играть решающую роль, значительно ограничивая обогащение по целевым последовательностям (45). Геномы млекопитающих слишком сложны, чтобы можно было достичь достаточно высоких скоростей реассоциации, и только значительные различия (такие, как наличие/отсутствие У хромосомы или протяжённые делеции) могут быть эффективно обнаружены в ходе ВГ. Кинетические параметры гибридизации могут быть улучшены при использовании более длительных сроков гибридизации, более высоких концентраций трейсера и драйвера, при повышении соотношения драйвер:трейсер, при наличии более длинных фрагментов ДНК в гибридизационных смесях, а также при использовании методов повышения скорости реассоциации - например, эффективными могут быть техника реассоциации в фенольной эмульси (англ. phenol emulsion reassociation technique - PERT) (46, 47) или техника исключения растворителя (solvent exclusion) (48). Более детально соображения относительно кинетических ограничений и их влиянии на эффктивность ВГ сложных геномных смесей даются в главе 7 настоящего обзора.
Помимо низкой скорости реассоциации, при сравнении сложных эукариотических ДНК встаёт также проблема геномных повторяющихся элементов (формирующих, например, более 40% ДНК млекопитающих (49, 50)). Повторяющиеся элементы реассоциируют значительно быстрее, чем уникальные геномные последовательности (45), так что получающиеся дифференциальные библиотеки в значительной мере обогащены по содержанию повторов (51). Это создаёт серьёзное препятствие для попыток непосредственного сравнения эукариотических геномных ДНК с помощью ВГ. Однако же, как предсказано в некоторых работах (43, 52), адекватная скорость реассоциации теоретически может быть достигнута и для сложных геномных смесей, при условии использования одноцепочечных трейсера и драйвера (9, 52, 53). К сожалению, после 1996 года, когда эта идея была опубликована, она никогда не осуществлялась на практике для полногеномных сравнений ДНК высших эукариот. Таким образом, проблема слабой применимости ВГ для сложных геномных смесей пока остаётся неразрешённой. Следует отметить, что все вышеуказанные соображения относительно кинетики реассоциации в ходе ВГ являются справедливыми и актуальными также и для всех остальных методов, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот в растворе.
1.2.3 Первый впечатляющий успех: репрезентативный дифференциальный анализ
В 1994 Николай Лисицын и коллеги опубликовали новый метод, основанный на ВГ, названный ими “репрезентативный дифференциальный анализ” (RDA) (54), что сделало вычитающую гибридизацию значительно более популярным подходом (см. Рис.1.3). Метод RDA широко используется до сих пор. RDA впервые применили для сравнения двух геномов млекопитающих и для клонирования дифференциальных последовательностей. Кинетические ограничения здесь обходятся благодаря случайному упрощению сравниваемых геномных смесей, что достигается либо благодаря использованию НЕ частощепящих эндонуклеаз рестрикции, либо благодаря эффекту ПЦР селекции.
На примере, проиллюстрированном на рисунке 1.4, геномные ДНК трейсера и драйвера фрагментируются эндонуклеазой рестрикции, и к фрагментированным ДНК лигируются различные олигонуклеотидные адапторы. Полученные лигазные смеси подвергают 50-100 циклам ПЦР амплификации с праймерами, специфичными для последовательностей адапторов. Благодаря широко известному эффекту «ПЦР селекции», различные фрагменты в сложных геномных смесях амплифицируются в ходе ПЦР с сильно различающимися эффективностями, зависящими, в основном, от размера фрагментов. В результате, большая часть исходных фрагментов ДНК оказывается недопредставленной или потерянной в полученных ампликонах, содержащих только около 2-10% от исходного разнообразия фрагментов. Ампликоны затем обрабатывают нуклеазой Mung bean для деградации 3'-концевых адапторных последовательностей (которые могли бы создать проблемы на следующей стадии благодаря кросс гибридизации адаптор-адаптор). Полученный трейсер затем смешивают с избытком драйвера, денатурируют и гибридизуют. Гибридизационную смесь инкубируют с ДНК полимеразой для заполнения 3' концов, а затем проводят ПЦР с праймером, специфичным к адаптору трейсера. При этом экспоненциально амплифицируются лишь дуплексы трейсер-трейсер, тогда как другие продукты гибридизации либо амплифицируются линейно, либо не амплифицируются вовсе. Экспоненциально амплифицированные двуцепочечные дуплексы могут быть легко клонированы в плазмидный вектор и секвенированы. Возможно проведение дополнительных раундов вычитания для повышения степени обогащения библиотеки дифференциальными последовательностями, присутствующими только в трейсере. Техника недорога, быстра и сравнительно проста; она позволяет работать с небольшими количествами исходного материала (геномной ДНК или кДНК). Поэтому неудивительно, что метод RDA стал популярен как для анализа транскриптов, так и для поиска геномных маркеров (55-60) (Рис. 1.3).
Рисунок 1.4. Применение метода репрезентативного дифференциального анализа (RDA) для идентификации дифференциальных последовательностей геномной ДНК. Упрощение исходной смеси геномной ДНК происходит за счёт 50-100 циклов ПЦР амплификации на стадии 3.
Однако же, техника RDA обладает серьёзным недостатком: в расчет берётся лишь небольшая часть транскриптома/генома, тогда как основная часть (90-98%) не анализируется. RDA не может быть использован для полногеномных сравнений ДНК, так как полученные с использованием этого метода результаты весьма фрагментарны. Другим минусом метода являестя большое количество фальш-позитивных сигналов при сравнении библиотек кДНК. Когда различия в спектре транскриптов малы, будет образовываться лишь небольшое количество дуплексов трейсер-трейсер, и линейная амплификация гибридов трейсер-драйвер может создать серьёзные проблемы при конструировании вычтенных библиотек (59). Картина становится ещё более пессимистичной, когда дифференциальные гены не только редки, но ещё и слабо транскрибируются. Несмотря на это, RDA в настоящее время широко используется; некоторые исследования, опирающиеся на результаты RDA, даже называются авторами «полногеномными и полнотранскриптомными», что на самом деле не так, как мы теперь знаем. С точки зрения автора настоящего обзора, RDA применим для поиска последовательностей дифференциальных маркёров для сравниваемых ДНК.
Поскольку интерес к вычитающей гибридизации повышался, было опубликовано несколько во многом дублирующих друг друга математических моделей ВГ, а также в 1995 г. были созданы две компьютерные программы, моделирующие ход ВГ in silico (45, 61). Далее будут описаны некоторые успешные и оригинальные экспериментальные приложения ВГ. Авторы первого исследования (62) предложили новую модификацию ВГ, включающую в себя гибридизацию продуктов вычитания с иммобилизованными на фильтре библиотеками кандидатного геномного локуса. Такое применение ВГ, по мнению авторов, позволяет проводить надёжное картивование геномных локусов, содержащих дифференциально транскрибируемые гены. Авторы другой статьи (63) применяли RDA для более эффективного субклонирования фрагментов дрожжевой искусственной хромосомы (YAC) в более мелкие векторы, подходящие для определения первичной структуры вставки. Геномы дрожжей, содержащих YAC (трейсер) и несодержащих YAC (драйвер) фрагментировали и подвергали вычитающей гибридизации; после нескольких раундов вычитания, продукты клонировали и секвенировали. Подавляющее большинство вставок содержало последовательности из YAC. Это очевидно многообещающее приложение ВГ не получило распространения, по-видимому, из-за прекращения использования YAC в крупномасштабных проектах по секвенированию геномов в пользу более стабильных бактериальных искусственных хромосом (BAC).