Материал: Рогожин В.В., Рогожина Т.В. Биохимия сельскохозяйственной продукции

Глава 8. Ферменты

8.1. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТОВ

От обычных функциональных белков ферменты отличаются тем, что на поверхности белковой глобулы у них располагается активный центр (рис. 8.1). Это участок, образованный из аминокислотных остатков, собранных из различных областей полипептидной цепи, где происходит связывание и превращение субстрата. При этом субстратом называется химическое соединение, претерпевающее изменение в ходе каталитического процесса. Кроме активного центра, у некоторых ферментов имеется еще и регуляторный участок (рис. 8.2). В этом участке связываются молекулы, оказывающие влияние на связывание и превращение субстрата в ферментативном процессе, хотя сами регуляторы не претерпевают изменений.

His;42

A

CD

Phe;142

B

Рис. 8.1. Пространственная структура (а) (Савицкий и др., 1998) и модель (б) (Veitch et al., 1992) активного центра пероксидазы

По размерам белковая глобула фермента превышает в несколько раз размеры субстрата. Это, возможно, обусловлено тем, что поверхностные аминокислотные остатки апобелка картируют поверхность клетки, определяя место связывания фермента на поверхности ее мембраны. При этом связывание поверхностных групп белка с функциональными группами мембранных структур определяет не только глубину его погружения в структуру мембраны, но и силу связывания белковой глобулы с поверхностными молекулами мембраны.

118

8.1. Физико-химические свойства ферментов

O

O

Рис. 8.2. Активный центр и регуляторный участок на поверхности белковой глобулы

В активном центре фермента могут располагаться аминокислотные остатки, содержащие различные функциональные группы, которые принимают участие в каталитическом процессе (табл. 8.1).

Условно активный центр фермента можно разделить на два участка: сорбционный, функциональные группы которого отвечают за связывание субстрата в активном центре фермента, и каталитический, в котором происходит превращение субстрата. Размер активного центра фермента определяется размером субстрата. Геометрия расположения функциональных групп активного центра соответствует природе субстрата, определяя эффективность его связывания и превращение в ходе химической реакции. Константа, характеризующая эффективность превращения субстрата в активном центре фермента, называется каталитической (kкат), а константа, определяющая сродство субстрата к ферменту, — константой связывания (Ks ≈ Km). Действие эффекторов (активаторов и ингибиторов) определяют с помощью констант активирования (Ка) и ингибирования (Ki), которые фактически являются равновесными константами.

Активность фермента зависит от проявления действия факторов среды и от свойств фермента. К факторам внешней среды можно отнести следующие:

•природа субстрата (субстратов) и концентрация;

•природа среды раствора;

119

Глава 8. Ферменты

•природа микросреды активного центра;

•температура, УФ облучение, давление;

•рН среды;

•присутствие активаторов и ингибиторов;

•ионная сила раствора.

Та б л и ц а 8 . 1

Функциональные группы ферментов и их рКа (Березин И. В. и др., 1976)

Действие факторов могут проявить наличие в среде активированных, ингибированных, денатурированных, модифицированных и рекомбинантных форм фермента.

К проявлению свойств фермента можно отнести следующее:

•природа и концентрация фермента;

•природа функциональных групп активного центра фермента, подвижность этих групп и их расположение;

•конформация белковой глобулы;

•межсубъединичные взаимодействия;

•наличие простетических групп и кофакторов;

•количество сульфгидрильных групп;

•количество изоферментов;

•наличие пассивной формы фермента (зимоген);

120

8.1.Физико-химические свойства ферментов

•рекомбинантные формы фермента;

•модифицированные формы фермента.

Влияние температуры. С повышением температуры активность ферментов возрастает, однако при температуре выше 40…60 °С наблюдается понижение активности фермента из-за разрушения нативной структуры белка. Возрастание температуры сопровождается увеличением подвижности функциональных групп в области активного центра и изменением конформации белковой глобулы, денатурацией фермента.

Влияние кислотности среды. Влияние рН на активность фермента проявляется через величины рК ионизирующих групп активного центра и функциональных групп субстрата. На активность фермента может также повлиять ионизация групп, входящих в состав белковой глобулы, преимущественно поверхностных аминокислотных остатков, приводящих к изменению конформации апобелка.

Изоферменты. Ферменты, имеющие одинаковый механизм действия, обладающие схожей субстратной специфичностью, но отличающиеся по физико-химическим свойствам, называются изоферментами. Различия между изоферментами проявляются в аминокислотном составе, сродстве к субстратам, температурном и рН оптимумах, действию ингибиторов и активаторов. Изоферменты можно разделить с помощью электрофореза, хроматографии, гель-фильтрации, ультрацентрифугирования. Синтез субъединиц изоферментов с четвертичной структурой находится под контролем различных генов, экспрессия которых зависит от их локализации

вразличных тканях растительного организма. Состав изоферментов может изменяться в зависимости от вида, сорта и возраста растения, фазы его развития, условий и места произрастания, функционального состояния, типа растительной ткани и органа. Так, в зерновках пшеницы методом электрофореза определяют от 7 до 10 изоформ малатдегидрогеназы, в корнях кукурузы — 4…5, в различных органах гороха — 9…12, в листьях хлопчатника — 7. Изоферментный состав пероксидазы из корней хрена представлен 10 изоформами, в листьях редьки их 18, в зародышах риса — 17,

влуковицах тюльпана — 12, в стеблях табака — 8.

Варьирование изоферментного состава сопровождается повышением адаптационных возможностей растительного организма, позволяя ему направленно изменять активность метаболических процессов, оказывая влияние на рост и деление клеток, развитие растительного организма, который способен за счет этого выработать механизмы, обусловливающие его приспособленность к окружающей среде,

Зимогены. Это неактивные формы ферментов (проферменты), относящиеся к группе протеиназ (сериновые, тиоловые, кислые); синтез зимогенов осуществляется на рибосомах эндоплазматического ретикулума особыми секреторными клетками в виде зимогенных гранул, которые после

121

Глава 8. Ферменты

завершения процесса мигрируют к поверхности клеток и затем секретируются в окружающую среду; достигнув места действия, они превращаются в активные формы ферментов. К ним относятся пепсиноген, активной формой которого является пепсин (основной протеолитический фермент желудочного сока), трипсиноген — трипсин, химотрипсиноген — химотрипсин, прокарбоксипептидазы — карбоксипептидазы (ферменты поджелудочной железы) и др. К зимогенам относятся и ферменты свертывания крови (факторы свертывания крови), компоненты и факторы системы комплемента.

8.2. ДЕНАТУРАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ

Ферменты в клетках живых организмов выполняют роль биологических катализаторов. В каталитическом действии фермента принимают участие аминокислотные остатки, содержащие –СООН, –NH2, –SH, –ОН и другие группы, входящие в состав активного центра, протонирование и депротонирование которых может влиять на его каталитические свойства. Поэтому активность ферментов зависит от рН среды, изменение которого может приводить к нарушению нативной структуры апобелка и конформации активного центра, что проявляется в утрате специфических каталитических свойств. Аналогично белкам, ферменты при повышении температуры изменяют свою конформацию, теряя способность катализировать превращения различных соединений. Так, например, пероксидаза катализирует реакцию окисления о-дианизидина перекисью водорода, однако длительное воздействие температурой выше 60 °С может приводить к денатурации фермента, уменьшению или к полной утрате его каталитической активности. Стабильность ферментов может возрастать в присутствии ионов Са2+, субстратов и белков, например альбумина.

8.3. КЛАССИФИКАЦИЯ И НОМЕНКЛАТУРА ФЕРМЕНТОВ

В настоящее время в соответствии с типом катализируемой реакции ферменты сгруппированы в 6 классов (рис. 8.3).

1 класс. Оксидоредуктазы — это ферменты, катализирующие реакции окисления и восстановления. Оксидоредуктазы подразделяются на 17 подклассов. Субстраты оксидоредуктаз являются донорами атомов водорода и электронов, и поэтому ферменты этого класса называются дегидрогеназами, или редуктазами (алкогольдегидрогеназа, лактатдегидрогеназа, малатдегидрогеназа, сукцинатдегидрогеназа, глиоксилатредуктаза, гид-

122