Материал: Рогожин В.В., Рогожина Т.В. Биохимия сельскохозяйственной продукции

Глава 8. Ферменты

Для нахождения кинетических констант уравнение Михаэлиса — Ментен преобразуют в уравнение двойных обратных величин (метод Лайнуивера — Берка)

1/v0 = (1/Vmах) + (Km /Vmах)(1/Sо)

или уравнение Иди — Хофсти

v0 = Vmах — Km(v0/Sо).

Если построить график в координатах (1/v0, 1/So), то получим прямую линию, пересекающую оси абсцисс и ординат в точках –1/Km и 1/Vmах соответственно. При этом тангенс угла будет равен величине Km /Vmах (рис. 8.5).

Рис. 8.5. График Лайнуивера — Берка

Для определения константы ингибирования непосредственно из графика можно использовать метод Диксона, откладывая экспериментальные данные в координатах (1/v0, [Iо]).

В каталитическом действии фермента заложен сложный регуляторный механизм, который может реализоваться при участии субстрата по следующей схеме:

Ks′ βkкат

[ES2] E + P

Ks′′

[ESn+2]

При этом реализуется следующий регуляторный механизм. Низкие концентрации субстрата инициируют каталитическую активность фер-

128

8.5. Регуляторное действие эффекторов ферментативных реакций

мента, тогда как при связывании двух молекул субстрата наблюдается активирование фермента (β > 1). Связывание нескольких молекул субстрата ингибирует фермент.

8.5.РЕГУЛЯТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ ЭФФЕКТОРОВ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

8.5.1. Ингибирование и активирование ферментов

Активность фермента регулируется с помощью различных соединений, которые способны связываться в области активного центра или регуляторного участка, расположенных на поверхности белковой глобулы. При этом проявляется эффект понижения или возрастания каталитической активности фермента. Эффекторы, вызывающие снижение или полное подавление активности фермента, называются ингибиторами, а повышающие активность энзима — активаторами. При этом механизмы ингибирования и активирования изучаются индивидуально для каждого фермента. Действие эффекторов является одним из элементов регуляторных процессов, осуществляющихся в биогенных системах.

Ферменты, синтез которых в клетке инициируется субстратом, называются индуцибельными. К этой группе ферментов относятся алькогольдегидрогеназа, нитратредуктаза, гексокиназа и др. Гены, ответственные за синтез индуцибельных ферментов, в основном находятся в репрессированном состоянии и активизируются только в присутствии субстрата. Ферменты, присутствующие постоянно в клетке в стационарных концентрациях, называются конститутивные.

Подробный анализ различных случаев ингибирования и активирования приводится в монографиях [Березин, Клесов, 1976; Березин, Мартинек, 1977]. Единой классификации эффекторов в настоящее время не существует. Однако наиболее часто встречающиеся типы ингибирования и активирования приведены ниже.

Конкурентный тип ингибирования проявляется в случае, если субстрат и ингибитор конкурируют за область связывания в активном центре фермента. При этом связывание ингибитора препятствует связыванию субстрата, замедляя протекание ферментативного процесса. Это наблюдается в том случае, когда ингибитор имеет схожее строение с субстратом или является субстратом с меньшим сродством к месту связывания. При этом график в координатах Лайнуивера–Берка имеет вид пучка прямых, пересекающихся на оси ординат (рис. 8.6).

Неконкурентный тип ингибирования проявляется в том случае, когда ингибитор и субстрат связываются в разных участках активного центра

129

Глава 8. Ферменты

[]

Рис. 8.6. График зависимости обратных начальных скоростей ферментативных реакций от концентрации субстрата в отсутствие (1) и в присутствии (2) конкурентного ингибитора

фермента. Однако при связывании ингибитора образуется фермент-суб- стратный комплекс, превращение в котором субстрата становится невозможным. График в координатах Лайнуивера–Берка имеет вид пучка прямых, пересекающихся на оси абсцисс (рис. 8.7).

[ ]

Рис. 8.7. График зависимости обратных начальных скоростей ферментативных реакций от концентрации субстрата в отсутствие (1) и в присутствии (2) неконкурентного ингибитора

При бесконкурентном типе ингибирования субстрат и ингибитор способны связываться в активном центре фермента, имея разные участки связывания. В присутствии ингибитора превращение субстрата несколько затрудняется, хотя его связывание несколько улучшается, т. е. ингибитор улучшает связывание субстрата, но ухудшает его превращение.

Антиконкурентный тип ингибирования проявляется при связывании ингибитора только с фермент-субстратным комплексом. При связывании

130

8.5. Регуляторное действие эффекторов ферментативных реакций

в активном центре фермента ингибитора останавливается каталитический процесс.

Смешанные типы ингибирования проявляются в случае взаимного влияния субстрата и ингибитора как при их связывании, так и при превращении субстрата. При этом графики в координатах Лайнуивера — Берка принимают вид семейства прямых с общей точкой пересечения в правом верхнем, левом верхнем или левом нижнем квадранте. Постоянные α и β характеризуют степень влияния ингибитора на каталитический процесс. Возрастание значения α(α>1) свидетельствует об ухудшении связывания субстрата в активном центре фермента, проявляемом в возрастании вели-

чин Km(каж) и Ki, тогда как понижение α (α < 1) может означать улучшение сродства субстрата у ферменту, сопровождаемое понижением значений

Km(каж) и Ki. Возрастание величины каталитической константы возможно при β > 1, а понижение — при значении β < 1.

Синергическая активация наблюдается в том случае, если связывание активатора в активном центре фермента, увеличивает сродство фермента к субстрату, проявляемое в понижении величины константы связывания.

Неконкурентная активация проявляется в случае, если субстрат и активатор связываются независимо в различных участках активного центра фермента. При этом образуется тройной комплекс, в составе которого фермент-субстрат-активатор. Связывание активатора ускоряет протекание каталитического процесса.

8.5.2. Аллостерические ферменты

На поверхности белковой глобулы фермента, помимо активного центра, может дополнительно присутствовать регуляторный участок, называемый аллостерическим центром. В этом центре могут связываться различные низкомолекулярные вещества (эффекторы), отличающиеся по строению от субстратов.

Связывание эффекторов в аллостерическом центре обусловливает конформационные перестройки белковой глобулы, что приводит к изменению активности фермента. При этом активность фермента может повышаться или понижаться. Ферменты, имеющие такой механизм регулирования активности, называются аллостерическими ферментами.

Аллостерический тип взаимодействия проявляется в S-образном характере кривой зависимости начальной скорости реакции от концентрации субстрата или эффектора. Такая зависимость обусловлена кооперативным механизмом, который проявляется в том, что связывание одной молекулы субстрата облегчает связывание второй молекулы субстрата, ускоряя протекание каталитической реакции.

131

Глава 8. Ферменты

8.5.3. Мультиферментные системы (метаболоны)

Интегрированность ферментов в ассоциативные комплексы обусловлена необходимостью проявления согласованного их действия в едином метаболическом процессе, протекающем в клетках живого организма. Образование мультиферментных комплексов происходит на поверхности или в структуре клеточных мембран. При этом обратимая адсорбция ферментов может выполнять роль регулятора каталитической активности, обеспечивая компартментализацию метаболитов.

Мультиферментные комплексы, адсорбированные на мембранах, обычно проявляют большую стабильность к действию денатурирующих факторов (температура, кислоты, щелочи, модификаторы и др.), чем индивидуальные формы ферментов.

В действии ферментов ассоциированных комплексов обычно проявляется эстафетный механизм, который осуществляется за счет того, что метаболиты остаются вблизи поверхности комплекса, обеспечивая последовательность протекания каталитических реакций. Такой механизм реализуется в действии ферментов гликолиза, пируват- и α-кетоглутарат- дегидрогеназных комплексов, цикла трикарбоновых кислот и др.

Упорядоченная сборка ферментов единого метаболического процесса создает условия для согласованного действия всех ферментов. В образовании комплекса принимает участие инициирующий формирование метаболона фермент. Так, для ферментов цикла трикарбоновых кислот таким ферментом служит сукцинатдегидрогеназа.

Образование сложных ферментных комплексов, участвующих в формировании пор мембран, обусловливает их участие в активном транспорте метаболитов через мембраны. Примером таких систем могут быть Na+,K+-АТФаза, Са2+-АТФаза, Н+-АТФаза и др.

Основной функцией мультиферментных комплексов является повышение эффективности ферментов, обусловливая их взаимную зависимость и кооперативность действия при минимуме энергетических затрат, при этом увеличивается каталитическая активность и термостабильность ферментативного комплекса, сочетающаяся с возможностью реализации регуляторных механизмов в ассоциированном комплексе.

8.6. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФЕРМЕНТОВ

Ферменты как биокатализаторы ускоряют протекание химических реакций в клетках живых организмов. Кроме того, они широко используются в биотехнологической, пищевой, кожевенной промышленностях, а также в медицине, сельском хозяйстве, фармацевтике и аналитических

132