Материал: спектроскопические методы анализа

зеркальной симметрии обычно указывает на различное геометрическое расположение ядер в основном и возбужденном состояниях.

Кроме геометрических перегруппировок отклонение от правила зеркальной симметрии могут вызвать также реакции в возбужденных состояниях. Так, например, для фенола и тирозина наблюдается по две полосы испускания, причем длинноволновое испускание более заметно при высоких концентрациях акцепторов протона. Величина рКа фенольной гидроксильной группы уменьшается от 11 в основном состоянии до 4 в возбужденном состоянии.

Правило Каши – спектр флуоресценции и фосфоресценции не зависит от длины волны возбуждающего света, так как излучательный переход может происходить только с самого нижнего возбужденного колебательного уровня.

Существуют исключения (например, азулен), когда испускание может происходить как из S2-, так и из S1-состояния. Кроме того, возбуждение на красном крае спектра поглощения часто ведет к сдвигу флуоресценции в длинноволновую область. Этот сдвиг обусловлен тем, что возбуждение на красном краю спектра избирательно возможно для тех флуорофоров, которые наиболее сильно взаимодействуют с растворителем.

Квантовый выход Q(φ) – отношение числа излучаемых квантов к числу поглощенных квантов светового потока. Этот показатель показывает эффективность преобразования энергии возбуждения в энергию излучения:

где N – количество излучаемых квантов; N0 – количество поглощенных квантов.

Закон Вавилова – квантовый выход флуоресценции Q не зависит от длины волны возбуждающего света, так как излучательный переход может происходить только с самого нижнего возбужденного колебательного уровня. Но в области наложения спектров поглощения и флуоресценции наблюдается уменьшение квантового выхода флуоресценции (рис. 3.47).

86

Рис. 3.47. Закон Вавилова

Флуоресцентная спектроскопия – эффективный метод исследования динамических процессов в растворах, представляющих интерес для биологов. Такая возможность связана в первую очередь с временем жизни возбужденных состояний. Вследствие принципа Франка – Кондона абсорбционная спектроскопия может дать информацию только об усредненных характеристиках основного состояния молекул, поглотивших свет. Поскольку только те молекулы растворителя, которые непосредственно соседствуют с поглощающими частицами, будут влиять на их спектр поглощения, абсорбционная спектроскопия может дать информацию лишь о некоторой средней сольватной оболочке растворителя, соседствующей с хромофором, и не отражает молекулярную динамику.

В противоположность этому параметры флуоресцентной спектроскопии являются чувствительными функциями всех процессов, протекающих за время жизни возбужденного состояния, причем в этих процессах могут участвовать молекулы, находящиеся в момент возбуждения на расстояниях до 100 Å от флуорофора. Хотя может показаться, что 10 нс – слишком короткий промежуток времени, фактически это большое время по сравнению с временем движения малых молекул в жидкой фазе. Вращательная диффузия связанных с белками и мембранами флуорофоров также укладывается в этот временной диапазон.

87

Молекулярная флуоресценция как аналитический инструмент

Аналитические методы, основанные на флуоресцентном детектировании, очень популярны из-за их высокой чувствительности и избирательности вместе с преимуществом пространственного и временного разрешения и возможностью дистанционного обнаружения с использованием оптических волокон.

Количественный анализ, использующий в качестве аналитического сигнала флуоресценцию анализируемого соединения, называется флуориметрией. Метод основан на использовании зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации флуорофора. При низких концентрациях флуорофора в растворе интенсивность флуоресценции (Iф) пропорциональна числу испущенных им квантов (N) и, следовательно, числу поглощенных квантов энергии (N0):

где kф – коэффициент пропорциональности.

Число поглощенных квантов энергии (N0) пропорционально поглощенному возбуждающему флуоресценцию излучению:

где I0 и I – интенсивности падающего и прошедшего через образец потоков света, соответственно. Тогда, в соответствии с основным законом светопоглощения (законом Бугера – Ламберта – Бера):

где ελ – коэффициент поглощения флуорофора при длине волны возбуждающего излучения.

концентрации флуорофора упрощается и превращается в линейную функцию:

88

Таким образом, интенсивность флуоресценции в определенном концентрационном интервале прямо пропорциональна концентрации флуофора. Именно этот концентрационный диапазон используется для количественного анализа, так как градуировочный график в этом случае линеен. Прямая пропорциональность часто соблюдается в пределах трехчетырех порядков концентрации флуорофора. На рис. 3.48 представлена зависимость аналитического сигнала метода от концентрации флуорофора.

Рис. 3.48. Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации флуорофора

Как правило, линейность градуировочного графика соблюдается при концентрациях флурофора до 10-4 моль/л. Основной причиной отклонения от линейности при высоких концентрациях флуорофора является дезактивация возбужденного состояния за счет увеличения доли безызлучательных переходов (концентрационное тушение). Таким образом, концентрация флуорофора в исследуемом растворе порядка 10 4 моль/л – это верхний предел определяемых концентраций для флуориметрии. При использовании этого метода следует следить за тем, чтобы концентрации используемых градуировочных растворов были ниже этого значения, а градуировочный график должен быть линейным и выходить из нуля.

Следует особо отметить, что интенсивность аналитического сигнала в флуориметрии очень велика, по этой причине флуориметрия –

89

высокочувствительный метод с пределом обнаружения порядка 10 8 %. Минимальная концентрация, которую можно определить данным методом (сmin), в среднем составляет 10 9 – 10 8 M. В зависимости от интенсивности флуорофора возможны определения до 0,001 – 0,1 мкг/мл. Так, например, оснащение обычного ВЭЖХ-хроматографа флуориметрическим датчиком позволяет проводить биофармацевтические анализы (например, анализ содержания метаболитов для фармакокинетики), которые требуют высокой чувствительности определений.

Принципиальная схема метода

Спектрофлуориметр (флуоресцентный спектрометр) отличается от спектрофотометра (адсорбционного) тем, что измерение флуоресценции обычно осуществляется под прямым углом. Поэтому используемая кювета (кварцевая) должна быть прозрачна со всех сторон. Прибор имеет два монохроматора (в простейшем случае – светофильтры), первый – на линии возбуждения, второй – на линии излучения (рис. 3.49).

Рис. 3.49. Принципиальная схема флуориметра

Современный спектрофлуориметр имеет два монохроматора, которые позволяют одновременно регистрировать спектры возбуждения и

90