Материал: спектроскопические методы анализа

Рис. 3.53. Люциферин-люциферазная реакция

Люминометр подсчитывает объем образовавшегося света и всего через 15 с выводит на дисплей информацию об уровне загрязнения. Вывод прост – чем выше показания измерительного прибора, тем выше уровень загрязнения.

Поскольку реакции биолюминесценции не требуют внешнего источника света (в отличие от процессов флуоресценции), то измерения можно проводить на темном фоне. В ходе эксперимента не наблюдается осложнений, связанных с разогревом и дрейфом источника света, помехами от рассеяния света и от возможных флуоресцентных компонентов. И именно поэтому биолюминесцентные методы сверхчувствительны, обеспечивают хорошее пространственное разрешение, широкий динамический диапазон и простую количественную оценку сигнала.

Так как АТФ можно найти во всех живых организмах, то по его наличию или отсутствию можно делать вывод о загрязненности пробы различными микроорганизмами: бактериями, спорами грибов и т.д. На сегодняшний день светлячковую люциферин-люциферазную систему и ее модификации используют для определения концентрации АТФ в широком ряду различных исследований.

Возможность использовать низкие концентрации реагентов породила набор методов высокопроизводительного скрининга для разработки лекарственных средств. Биолюминесцентный анализ по репортерным генам позволил совершить значительный прогресс в фундамендальных и прикладных областях науки: от изучения молекулярных взаимодействий до экологического мониторинга.

И, наконец, неинвазивный биолюминесцентный имиджинг in vivo вырос в мощную альтернативу другим имиджинговым технологиям, трансгенные биолюминесцентные животные становятся удобными

96

моделями для проведения доклинических испытаний и патофизиологических исследований.

Также по изменению уровня АТФ можно оценить воcприимчивость бактерий к антибиотикам. Замечательным свойством данного метода, помимо его исключительной скорости, является то, что молекула АТФ может быть обнаружена в концентрации до 1·10 18 моль, что в реальности соответствует пяти бактериальным клеткам.

Ранее использовавшиеся микробиологические тесты на загрязнение на сегодняшний день устарели, поскольку результаты надо ждать от 2 до 6 дней, в то время как стандартный АТФ тест занимает лишь 15 – 20 с и при этом гораздо более чувствителен.

Влияние молекулярной структуры на флуоресценцию

Большинство флуоресцентных соединений – ароматические или гетероароматические. Некоторые алифатические соединения с высокой степенью ненасыщенности также флуоресцентны. Увеличение в протяженности π-электронной системы (т.е. степени сопряжения) приводит к сдвигу спектров поглощения и флуоресценции в область больших длин волн и к увеличению квантового выхода флуоресценции. Это простое правило проиллюстрировано гомологическим рядом линейных ароматических углеводородов: нафталином, антраценом, нафтаценом и пентаценом, которые испускают флуоресценцию в ультрафиолетовой, синей, зеленой и красной областях, соответственно.

Низколежащие переходы в ароматических углеводородах относятся к π→π* типу, который характеризуется большими молярными коэффициентами поглощения и относительно высокими квантовыми выходами флуоресценции. Когда гетероатом вовлечен в π-систему, переход n→π* может быть низколежащим переходом.

По химическому строению флуоресцентные красители, использующиеся в настоящее время – это ароматические и гетероциклические соединения с электронодонорными и (или) электроноакцепторными заместителями. Наиболее интенсивной

97

флуоресценцией обладают, как правило, 5- и 6-членные гетероциклические фрагменты, включенные в развитую систему сопряженных связей. Существенную роль играет жесткость молекулы, исключающая возможность безызлучательных процессов релаксации через колебания и вращение отдельных фрагментов системы. Электронодонорные заместители в большинстве случаев повышают, а электроноакцепторные – понижают интенсивность люминесценции.

Флуоресцентные красители применяются либо в разбавленных растворах (при этом увеличение концентрации флуоресцентных красителей может снижать интенсивность флуоресценции, за счет эффекта концентрационного тушения), либо в кристаллическом состоянии.

К флуоресцентным красителям относятся широко применяемые в быту и технике оптические отбеливатели, а также соединения ряда флуоресцеина и родамина (группа ксантеновых красителей). Последние используются при изготовлении флуоресцентных пигментов. Эти пигменты придают краскам повышенную яркость (в 1,5 – 2 раза выше, чем у обычных красок) благодаря тому, что к отраженной части видимого спектра прибавляется флуоресценция.

Среди природных соединений веществ с высокой способностью к флуоресценции довольно мало. Большинство флуорофоров, нашедших широкое практическое применение в различных областях научных исследований и промышленности, создано синтетически.

В настоящее время существует большое разнообразие искусственных флуорофоров с различными фотофизическими свойствами. Основные классы:

малые органические красители,

координационные соединения лантаноидов,

флуоресцентные белки,

полупроводниковые нанокристаллы.

Каждый класс имеет свои специфические особенности, преимущества и недостатки.

Малые органические флуорофоры. Малые органические флуорофоры – крупнейший класс флуоресцентных соединений. В большинстве случаев это относительно небольшие органические вещества,

98

содержащие несколько сопряженных ароматических фрагментов (рис.

3.54).

Рис. 3.54. Структурные формулы органических флуорофоров

Флуоресцентными свойствами обладает чрезвычайно большое количество органических соединений, но практическое значение имеет только ограниченное их количество – производные нескольких базовых структур. Это производные кумарина, флуоресцеина, родамина, борфторидных комплексов дипирролилметена BODIPY, цианиновые и сквариновые красители (рис. 3.54).

Цвет флуоресценции малых органических красителей может варьироваться в очень широких пределах. Так, например, производные кумарина и флуоресцеина имеют синюю и зеленую флуоресценцию соответственно. Производные родамина и BODIPY могут иметь желтокрасную флуоресценцию, тогда как на базе цианинов и скваринов созданы красители, которые флуоресцируют в красном и ближнем инфракрасном цвете. Флуоресценцией красителя можно управлять, изменяя природу функциональных групп, присоединенных к флуорофору.

Другой особенностью малых органических флуорофоров является то, что их флуоресценцию можно «включать» с помощью минимальных

99

изменений в химической структуре. Это широко используется в создании флуоресцентных зондов на основе таких молекул. Примером служит флуоресцеин, который может существовать в форме двух таутомеров: в нефлуоресцентной лактонной форме и флуоресцентной открытой форме.

Значительное преимущество органических флуорофоров – возможность менять их фотофизические свойства с помощью варьирования функциональных групп. Другими преимуществами считаются малый размер и возможность селективного ковалентного мечения биомолекул. К недостаткам относят умеренные квантовые выходы флуоресценции, низкая яркость, низкая химическая стабильность и быстрое фотообесцвечивание под действием лазерного излучения.

Координационные соединения. Флуоресцентные свойства присущи некоторым катионам металлов из группы лантаноидов (Ln3+). За поглощение и излучение света этими атомами отвечают переходы электронов f-подуровня, которые в большинстве случаев квантовомеханически запрещены. Поэтому флуоресценция лантаноидов имеет определенные особенности, в частности очень длинные времена жизни возбужденного состояния, которые на 3 – 4 порядка выше, чем времена жизни органических флуорофоров. Из-за наличия нескольких возможных электронных переходов с разными энергиями, в спектрах флуоресценции лантаноидов наблюдается набор отдельных полос, характерных для каждого элемента. Цвет эмиссии может варьироваться от голубого (Tm) до инфракрасного (Er). Обычно лантаноиды используют в форме комплексов с органическими лигандами, которые повышают эффективность возбуждения атомов металла (сенсибилизация).

Флуоресцентные белки. Важной группой флуорофоров являются флуоресцентные белки. Первый представитель этого класса – зеленый флуоресцентный белок (ЗФБ) – был выделен из медузы Aequorea victoria в 1962 году. Это относительно небольшой белок с молекулярной массой 27 кДа, который поглощает синий свет и флуоресцирует зеленый.

В 1996-м году трехмерное строение дикого ЗФБ и его мутантов было исследовано методом дифракции рентгеновских лучей. Было выяснено, что белок имеет структуру, подобную цилиндру, который образован несколькими бета-листами. В центре цилиндра расположен флуорофор,

100