Материал: спектроскопические методы анализа

флуоресценции. Пример такого спектра представлен на рис. 3.50.

Рис. 3.50. Трехмерный спектр поглощения антрацена

Использование спектрофлуориметрии

Прямая (на основе градуировочного графика) спектрофлуориметрия возможна в тех случаях, когда определяемое соединение способно к собственной флуоресценции. Это возможно для ароматических углеводородов (например, в сырых нефтях), белков (например, в сыворотке крови, в коровьем молоке), некоторых лекарств (например, морфина), хлорофилла и т.п.

Описаны многочисленные области применения: анализ загрязнителей воздуха и воды, анализ нефти, пищи, лекарств; мониторинг промышленных процессов; контроль веществ медицинского назначения; криминология и т.п.

Однако большинство ионов и молекул нефлуоресцентны, и основные косвенные методы, которые используются в этом случае, следующие:

Преобразование (дериватизация), т. е. реакция анализируемого вещества с реагентом, ведущая к образованию флуоресцентного

91

соединения. Наиболее часто дериватизацию используют в жидкостной хроматографии вместе с флуоресцентным определением. В настоящее время этот метод применяют в биохимии и клинической химии. На рис. 3.51 приведена схема дериватизации, которую часто применяют для регистрации первичных аминов, не обладающих собственной флуоресценцией.

Рис. 3.51. Пример флуоресцентной дериватизации первичных аминов

В качестве дериватизирующего агента используют реагент флуорескамин. Продукт, получающийся в результате реакции, обладает яркой флуоресценцией и позволяет определять любые первичные амины. Эту реакцию можно применить и для регистрации белков, имеющих первичные аминогруппы.

Образование флуоресцентного продукта реакции – основа большинства методов определения ионов и молекул.

Затухание флуоресценции, протекающее в результате столкновения анализируемого вещества с флуоресцентным соединением. Этот метод особенно хорошо подходит для обнаружения газов, таких как кислород (растворенный в воде или крови), SO2, H2S, аммиак, HCl, Cl2, хлоруглеродов и т.д.

Флуоресцентный метод измерения парциального давления кислорода

Кислород, будучи триплетной молекулой, способен эффективно тушить флуоресценцию и фосфоресценцию некоторых люминофоров.

92

Этот эффект (впервые описанный австрийским химиком Хансом Каутским в 1939 г.) называется «динамическим тушением флуоресценции». Столкновение молекулы кислорода с флуорофором в возбужденном состоянии приводит к безызлучательной передаче энергии. Степень тушения зависит от частоты столкновений, а следовательно, от концентрации, давления и температуры кислородсодержащей среды.

Излучение, как правило, синего (~ 475 нм) светодиода передается в зонд по оптическому волокну и возбуждает флуоресценцию специально подобранного химического комплекса, внедренного в тонкослойное зольгелевое покрытие на конце зонда. Гидрофобная золь-гелевая матрица эффективно удерживает флуоресцирующий комплекс и защищает его от воды. Возбужденный комплекс флуоресцирует в видимой области спектра с максимумом вблизи 600 нм. При столкновении с молекулой кислорода происходит безызлучательная передача избыточной энергии, что приводит к уменьшению, или тушению, сигнала флуоресценции. Степень тушения зависит от концентрации кислорода в золь-гелевом покрытии, которая находится в динамическом равновесии с концентрацией кислорода в образце. Излучение флуоресценции собирается зондом и по оптическому волокну передается в спектрометр. Полученный спектр и данные его обработки отображаются на дисплее или на компьютере.

В качестве красителей (флуорофоров), обладающих флуоресценцией, могут быть применены полимерные композиции на основе полиароматических красителей, например, пирена или декациклена, а также на основе флуоресцирующих комплексов рутения Ru(bpy)3, Ru(phen)3, [Ru(dpp)2Phen]2+, где dpp = 4,7-дифенил-1,10-фенантролин, Phen = 1,10-фенантролин, или допированного в пленку оксида алюминия комплекса тербия (III) с ацетилацетоном и 1,10-фенантролином (Tb(acac)3phen), рис 3.52. Аналогично можно применять фосфоресцирующие красители порфириновой природы, Pt- и Pdкомплексы порфиринов.

Время отклика зонда ограничено скоростью диффузии кислорода в покрытие. В вязких образцах отклик определяется диффузией через образец. Зонд будет откликаться достаточно быстро в воде и заметно медленнее в маслах, эмульсиях.

93

Рис. 3.52. Примеры флуоресцентных комплексов для измерения парциального давления кислорода

В воде диапазон измерений составляет 0 – 40,7 ppm (парциальное давление 0 – 760 мм рт. ст.). В отличие от электродов, оптический зонд не расходует кислород. Это означает, что перемешивание образца уменьшает время отклика, но не влияет на конечные равновесные показания. При нанесении на зонд дополнительных покрытий, предохраняющих от засветки и увеличивающих химическую стойкость, время отклика увеличивается до 30 – 50 с в жидкостях.

Затухание флуоресценции также используют для изучения комплексообразования флуоресцентных молекул с соединениями, не обладающими флуоресценцией в том случае, когда продукт комплексообразования приводит к уменьшению или исчезновению люминесценции. Примером может служить альбумин, который обладает собственной флуоресценцией за счет входящего в состав его молекулы триптофана. Константы связывания альбумина с антибиотиками можно рассчитать, используя явление затухания его флуоресценции при образовании комплекса с молекулой антибиотика.

Наконец, иммунофлуоресцентный анализ – метод, имеющий большую важность для биохимического, диагностического, лабораторного и биомедицинского применения. Иммунофлуоресцентный анализ (ИФА, или МФА – метод флуоресцирующих антител, иммунофлуоресценция) – набор иммунологических методов для качественного и количественного определения поверхностных и внутриклеточных антигенов в образцах

94

клеточных суспензий. Метод позволяет детально анализировать биологические образцы на присутствие определенных антигенных детерминант, характерных для определенных возбудителей или заболеваний, проводить количественную оценку как поверхностных, так и внутриклеточных белков и рецепторов.

Общее микробное число. Метод АТФ

Определение общего микробного числа основано на принципе биолюминисценции и относится к скрининговым методам, что позволяет быстро и безопасно выявлять потенциально опасные биологические риски. Тест обязательно применяют для оценки качества технических и сточных вод, реже питьевой воды. В основе лежит люциферин-люциферазная реакция – аналитический методом определения аденозинтрифосфата (АТФ). Когда в 1947 году МакЭлрой показал, что в реакции биолюминесценции светляка одним из обязательных компонентов является АТФ, в биохимическом анализе была открыта новая глава.

Молекула АТФ – универсальный энергетический носитель в клетке. Основная масса АТФ синтезируется на мембранах митохондрий. Множество ферментов используют АТФ в катализируемых ими превращениях. Концентрация АТФ внутри клетки всегда поддерживается примерно на одном и том же уровне, поэтому изучение ее варьирования позволяет оценить метаболический потенциал клеток. До тех пор пока клетка здорова и функционирует, она стремится сохранить нормальный уровень АТФ, однако когда клетка умирает, уровень АТФ стремительно падает. Изучение уровня АТФ в клетках позволяет оценить действие различных агентов на их пролиферацию или измерить цитотоксичность.

Для осуществления данного метода анализа необходима биохимическая реакция фермента люциферин/люцифераза (специальный реактив) с молекулами АТФ микроорганизмов, находящихся в анализируемой воде. Когда молекулы АТФ вступают в контакт с жидким люциферин/люциферазным реагентом, происходит генерирование холодного света (рис. 3.53).

95