АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
??????????-?????????????? ???????? ?????????????? ?????????? ????????????? ?????????? ??? ???????????????? ??????
14.00.15 - патологическая анатомия
?????????? ???????
Волгоград - 2006
Работа выполнена в ГОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию
Научный руководитель - доктор биологических наук профессор
Славинский Александр Александрович
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор
Новочадов Валерий Валерьевич
доктор медицинских наук профессор
Богомолова Нина Викторовна
Ведущая организация - Государственное некоммерческое учреждение - ?Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук?
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Железодефицитная анемия (ЖДА) - это широко распространенная патология эритрона. Основным этиологическим фактором заболевания часто становится хроническая кровопотеря, как правило, связанная либо с патологией желудочно-кишечного тракта, либо с обильными менструальными кровотечениями у женщин детородного возраста (Левина А.А. и соавт., 2001; Козинец Г.И. и соавт., 2003). Истощение общего количества железа в организме приводит к появлению анемического и сидеропенического синдромов (Воробьев П.А., 2001; Погорелов В.М. и соавт., 2004).
ЖДА сопровождается снижением активности железосодержащих окислительно-восстановительных ферментов клеток различных тканей, что способствует развитию мышечной слабости, кардиомиопатии, вызывает дистрофические и атрофические изменения кожи и слизистых оболочек (Зюбина Л.Ю. и соавт., 2002; Малова Н.Е. и соав., 2002; Schaefer N. et al., 2004; Gupta K. et al., 2006). При дефиците железа нарушается миелинизация нервных волокон, возникают изменения в интеллектуальной сфере (Lozoff B. et al., 2000; Algarin C. et al., 2003).
Рядом исследований установлено, что при ЖДА появляются изменения в гуморальном и клеточном звене иммунной системы (Сафуанова Г.Ш. и соавт. 2002, 2004; Eciz С. et al., 2005). Больные с ЖДА чаще страдают от инфекционно-воспалительных заболеваний, принимающих у них хроническое течение (Левина А.А. и соавт., 2001; Жданова Е.В. и соавт., 2002; Демихов В.Г., 2003). Патогенетические механизмы этого явления до сих пор остаются мало изученными. Учитывая, что нейтрофильные лейкоциты играют важную и порой определяющую роль в развитии воспалительных процессов, представляет интерес исследование функциональной активности этих клеток при ЖДА.
Нейтрофильные лейкоциты первыми появляются в зоне повреждения ткани (Мазинг Ю.А., 1991; Пауков В.С. и соавт., 2005). Дегрануляция нейтрофилов с выбросом компонентов антибактериальных систем в фагоцитарные вакуоли или внеклеточное пространство способствует уничтожению микроорганизмов и очищению очага воспаления от некротизированных тканей (Саркисов Д.С., Пальцын А.А., 1992; Сапрыкин В.П., Галанкин В.Н., 1998; Faurschou M., Borregaard N., 2003; Brinkmann V. et al., 2004).
Депрессия функциональной активности нейтрофилов приводит к возникновению и прогрессированию гнойно-септических процессов (Галанкин В.Н., Токмаков А.М., 1991; Хаитов Р.М, Пинегин Б.В, 1995; Tralau T. et al., 2004). Исследование функционально-метаболической активности нейтрофильных лейкоцитов крови с применением компьютерной морфометрии клеточного изображения представляется актуальным в связи с глобальной распространенностью железодефицитных состояний для более глубокого понимания деятельности защитных систем организма у больных ЖДА и в интересах дифференциальной диагностики патологии эритрона.
Цель исследования. Выявить характерные для железодефицитной анемии структурно-цитохимические изменения в нейтрофильных лейкоцитах периферической крови, связанные с нарушением функционально-метаболической активности внутриклеточных антибактериальных систем и ядерного хроматина.
Задачи исследования:
1. Выявить обусловленные дефицитом железа изменения в зернистости нейтрофильных лейкоцитов на основе компьютерного мониторинга цитохимических маркеров гранул: миелопероксидазы, НАДФН-оксидазы, щелочной фосфатазы, нафтол-AS-D-хлорацетат эстеразы и неферментных катионных белков.
2. Оценить активационный потенциал ядер нейтрофильных лейкоцитов в периферической крови у больных ЖДА по интенсивности анизотропного эффекта хроматина.
3. Определить изменение активности железосодержащих и не содержащих железо компонентов антибактериальных систем нейтрофилов в зависимости от степени тяжести ЖДА.
4. Установить характер взаимосвязи между цитохимическими признаками функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов крови и показателями состояния периферического звена эритрона у больных ЖДА.
5. Выявить различия структурно-цитохимических признаков функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов крови у больных с острой и хронической постгеморрагической (железодефицитной) анемией.
Научная новизна работы:
1. Получены новые данные, характеризующие состояние железосодержащих (миелопероксидаза, НАДФН-оксидаза) и не содержащих железо (щелочная фосфатаза, нафтол-АS-D-хлорацетат эстераза) компонентов антибактериальных систем нейтрофилов крови у больных с ЖДА.
2. Выявлены неизвестные ранее морфофункциональные особенности ядер нейтрофильных лейкоцитов у больных ЖДА, связанные с увеличением в них количества сегментов и доли гетерохроматина.
3. Представлены новые сведения о возрастании активности миелопероксидазы и щелочной фосфатазы в нейтрофильных лейкоцитах периферической крови у больных с острой постгеморрагической анемией, указывающие на повышение функциональной активности этих клеток.
4. Предложен новый способ для оценки состояния запасного фонда железа, основанный на определении количества сидероцитов в периферической крови.
Научно-практическая значимость работы. Новые данные об угнетении функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов у больных с ЖДА расширяют современные представления о состоянии иммунной системы при этой патологии эритрона, поэтому могут применяться в научно-исследовательской работе, а также в учебном процессе со студентами медицинских и биологических специальностей.
Выявленные различия в активности цитохимических маркеров антибактериальных систем нейтрофилов у больных с острой и хронической постгеморрагической анемиями могут быть использованы в дифференциальной диагностике патологии эритрона. Определение содержания сидероцитов в периферической крови может применяться в оценке запасного фонда железа при железодефицитных состояниях.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Нейтрофильные лейкоциты периферической крови больных с железодефицитной анемией характеризуются депрессией функционально-метаболической активности, которая проявляется структурно-цитохимическими изменениями в цитоплазматической зернистости и обусловлена зависимым от концентрации гемоглобина в крови угнетением активности железосодержащих ферментов миелопероксидазы и НАДФН-оксидазы. Не содержащие железо компоненты антибактериальных систем сохраняют свой функциональный потенциал в нейтрофилах больных, однако активность щелочной фосфатазы снижается при среднетяжелом течении заболевания.
2. В ядрах нейтрофильных лейкоцитов периферической крови у больных с железодефицитной анемией возрастает анизотропный эффект, что указывает на увеличение доли гетерохроматина и угнетение активационного потенциала ядер. Наряду с этим в крови повышается количество полисегментированных нейтрофилов.
3. Острая постгеморрагическая анемия характеризуется активацией нейтрофильных лейкоцитов в периферической крови. В цитоплазме клеток возрастает активность миелопероксидазы и щелочной фосфатазы. Сохраняются показатели активности НАДФН-оксидазы и нафтол-АS-D-хлорацетат эстеразы, а также содержание неферментных катионных белков. Морфофункциональные параметры ядер нейтрофилов не изменяются.
Внедрение результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, из них 4 в центральной печати.
Основные положения диссертации представлены на ХХХII научно-практической конференции студентов и молодых ученых вузов ЮФО (Краснодар, 2005), научно-практической конференции КГМУ и сессии Центрально-Черноземного научного центра РАМН (Курск, 2005), IV всероссийской конференции молодых ученых и студентов по медицине (Тула, 2005), IХ конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежь и медицинская наука в 21 веке» (Киров, 2005), конференции молодых ученых и студентов «Актуальные вопросы медицинской науки и здравоохранения» (Краснодар, 2005), международном конгрессе «Иммунитет и болезни: от теории к терапии» (Москва, 2005), ХХХIII конференции студентов и молодых ученых вузов ЮФО (Краснодар, 2006).
Работа выполнена на кафедре патологической анатомии Кубанского государственного медицинского университета. Материалы исследования внедрены в учебный процесс кафедр патологической анатомии, клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики. Практические рекомендации используются в работе отдела клинической и экспериментальной иммунологии ЦНИЛ Кубанского государственного медицинского университета.
Апробация работы осуществлена на расширенном заседании сотрудников кафедр патологической анатомии, патологической физиологии, гистологии, клинической иммунологии, аллергологии и лабораторной диагностики Кубанского государственного медицинского университета 7 сентября 2006 года.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц, 21 рисунок (гистограммы, изображения эритроцитов и нейтрофильных лейкоцитов). Работа состоит из введения, 6 глав, выводов, указателя использованной литературы. Библиография включает 253 источника, из них 83 на русском языке и 170 - на иностранных языках.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследована периферическая кровь 102 больных с ЖДА, развившейся в результате нарушения менструального цикла по типу менометроррагии на фоне лейомиомы матки в сочетании с аденомиозом. В соответствии с уровнем гемоглобина крови больные были разделены на две группы. Группа с легким течением ЖДА состояла из 72 женщин (уровень гемоглобина от 120 до 90 г/л). Группа со средней степенью тяжести ЖДА - из 30 больных (уровень гемоглобина от 90 до 70 г/л). Сравнение результатов исследования проводили с группой, состоящей из 29 больных лейомиомами матки и аденомиозом без клинико-лабораторных проявлений анемии (группа сравнения). В контрольную группу выбраны 60 практически здоровых женщин. Данные, полученные у больных с ЖДА, сопоставлены с результатами исследования 35 больных лейомиомами матки и аденомиозом, у которых основное заболевание осложнилось маточным кровотечением с развившейся на 1-2 сутки после него острой постгеморрагической анемией.
Диагноз ЖДА подтвержден определением уровня сывороточного железа, ферритина, насыщения трансферрина железом. Исследование показателей периферического звена эритрона проведено при помощи проточного счетчика ''Cobas Micros 18 OT'' (АВХ, Франция). Основной диагноз поставлен на основании гистологического исследования операционного материала.
В нейтрофильных лейкоцитах определяли активность ферментов, а также содержание цитоплазматических неферментных катионных белков. Исследовали уровень активации ядерного хроматина и сегментацию ядер. В эритроцитах определяли включения - ретикулофиламентозную субстанцию и сидеросомы. После всех цитохимических реакций проведена компьютерная морфометрия изображения нейтрофильных лейкоцитов (15000 клеток здоровых людей и 40250 клеток больных).
Активность НАДФН-оксидазы в нейтрофилах определяли с помощью НСТ-теста (Нестерова И.В., 1980), миелопероксидазы - бензидиновым методом (Satо А., 1928). Активность нафтол-AS-D-хлорацетат эстеразы осуществляли по методике А.А. Славинского и Г.В. Никитиной (2000), щелочной фосфатазы - по методу М.Г Шубича (1965). Определение содержания неферментных катионных белков проводили по методике А.А. Славинского и Г.В. Никитиной (1999).
Исследование ядер нейтрофилов включало оценку степени сегментации и активационного потенциала. Для определения степени сегментации нами предложены два расчетных критерия: индекс сегментации ядер, представляющий собой среднее значение количества сегментов в расчете на одну клетку, и показатель полисегментации ядер, соответствующий проценту нейтрофилов в мазке крови, ядро которых состоит из 4 и более долей. Активационный потенциал ядер определяли поляризационно-оптическим методом по анизотропным свойствам ядерного хроматина (Евглевский А.А., 2000).
В периферическом звене эритрона оценивали структурные изменения эритроцитов. Определены эритроцитарные индексы и внутриклеточные включения. Включения негеминового железа выявляли реакцией на берлинскую лазурь, ретикулофиламентозную субстанцию - суправитальной окраской с метиленовым синим (Козинец Г.И. и соавт., 2004). Для оценки регенераторной способности костного мозга использовали расчетный критерий - ретикулоцитарный индекс (Погорелов В.М. и соавт., 2004).
Компьютерную морфометрию изображения нейтрофильных лейкоцитов проводили при помощи цветной телевизионной системы для микроскопических исследований ''MagiScop'', изготовленной в НИИ Телевидения (Санкт-Петербург). Применяли пакеты прикладных программ ''Magisoft'' и ''Видеотест''.