Изображение, сформированное иммерсионной системой микроскопа, вводили через телекамеру в видеопамять компьютера. С помощью программной линейной аппроксимации увеличивали изображение клетки. Для равномерной очистки изображения от высокочастотных шумов делали медианную фильтрацию. В цветовом координатном пространстве LSH выполняли контрастирование изображения по гистограмме яркости. Производили бинаризацию изображения по цвету цитохимической реакции (рис.1). В автоматическом режиме измеряли параметры бинарных изображений. Определяли суммарные и средние значения площади и оптической плотности образовавшегося в клетке продукта цитохимической реакции.
Для оценки результатов компьютерной морфометрии использован вычисляемый критерий - интегральный цитохимический показатель (ИЦП), представляющий собой произведение суммарной площади продукта цитохимической реакции в клетке и его оптической плотности (Славинский А.А., 2000).
Обработка результатов компьютерной морфометрии с помощью программы "Microsoft Excel" включала построение вариационных рядов и создание сводных электронных таблиц. Для оценки значимости различий между средними значениями двух выборок вычислен критерий Стьюдента (t). Для сравнения нескольких групп с одной определен критерий Даннета (q'). Количественную оценку взаимосвязи двух наборов данных проводили с вычислением коэффициента ранговой корреляции Спирмена (rs) (Гланц С., 1999; Новиков Д.А., Новочадов В.В., 2005).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
периферическое звено эритрона
У больных с легкой степенью ЖДА количество эритроцитов, содержащих включения негеминового железа (сидероцитов) в периферической крови составило 1,03±0,08‰, что в 1,6 раза меньше, чем у больных без анемии (р<0,01). При средней степени тяжести количество сидероцитов снижено в 2,7 раза (р<0,01), что может быть признаком истощения запасного фонда железа у этих больных.
Содержание ретикулоцитов не изменяется при легкой степени ЖДА, а при средней степени снижается до 2,84±0,07‰, что в 1,3 раза меньше (р<0,01) по сравнению с больными без анемии (рис.2). Ретикулоцитарный индекс снижен в 1,5 раза при легкой степени анемии, а при средней степени тяжести - в 2,4 раза (р<0,01). Это свидетельствует об угнетении эритропоэза и развитии гипорегенераторного состояния красного костного мозга у больных ЖДА.
В отличие от ЖДА острая постгеморрагическая анемия не сопровождается изменением количества сидероцитов и ретикулоцитов в периферической крови больных. При этом виде анемии не изменяется ретикулоцитарный индекс, что свидетельствует о сохранении эритропоэтической функции костного мозга.
Установлена прямая корреляционная связь средней силы (rs=0,51) между содержанием сидероцитов в периферической крови и уровнем гемоглобина. Падение уровня гемоглобина крови сопровождается уменьшением количества эритроцитов, в которых обнаруживаются гранулы негеминового железа. Увеличение показателей микроцитоза и гипохромии эритроцитов при ЖДА также коррелирует со снижением количества сидероцитов в крови.
цитохимические признаки функциональной активности нейтрофильных лейкоцитов
Цитохимические маркеры антибактериальных систем в цитоплазме нейтрофильных лейкоцитов имеют диффузную и гранулярную области распределения (Славинский А.А., 2000). В связи с этим в процессе компьютерной морфометрии клеточного изображения измерениям подвергалась зона диффузно-гранулярного распределения цветного продукта цитохимических реакций (ДГ-зона).
Реализация кислородзависимого механизма антибактериальной защиты происходит при участии НАДФН-оксидазы и миелопероксидазы. Оба эти фермента в своем составе имеют железо, что позволило нам объединить их в группу железосодержащих компонентов антибактериальных систем нейтрофильных лейкоцитов.
Железосодержащие компоненты антибактериальных систем. Миелопероксидаза обнаружена в 59,2±9,7% нейтрофилов периферической крови у больных с легким течением ЖДА, что в 1,6 раза меньше, чем у больных без анемического синдрома (р<0,05). Активность фермента снижена в 1,9 раза (рис. 3А). Компьютерная морфометрия клеточного изображения показала, что снижение активности фермента при ЖДА обусловлено уменьшением площади ДГ-зоны в цитоплазме нейтрофилов.
У больных со средней степенью ЖДА количество клеток, в которых выявлена активность миелопероксидазы, меньше в 2 раза (р<0,05). Активность фермента снижена в 2,3 раза, что связано с уменьшением в цитоплазме нейтрофилов площади ДГ-зоны фермента в 3,4 раза (р<0,01).
При острой постгеморрагической анемии количество нейтрофилов с положительной реакцией на миелопероксидазу не имело статистически значимых различий при сравнении с больными без анемии (р>0,05). Однако активность фермента возросла в 1,5 раза (р<0,01).
НАДФН-оксидаза при легкой степени ЖДА выявлена в 24,3±4,5% нейтрофилов периферической крови, что в 2,3 раза меньше, чем у больных без анемии (р<0,01). Активность фермента снижена в 1,4 раза (рис. 3.Б.). При компьютерной морфометрии клеточного изображения установлено, что в нейтрофильных лейкоцитах площадь ДГ-зоны продукта цитохимической реакции на НАДФН-оксидазу уменьшена в 1,4 раза (р<0,05).
При средней степени ЖДА процент клеток, в цитоплазме которых обнаружена активность НАДФН-оксидазы, в 3 раза ниже, чем у больных без анемии (р<0,01). Активность фермента в нейтрофилах снижена до 5,03±0,3 отн.ед., что в 1,4 раза меньше по сравнению с больными без анемического синдрома (р<0,01). Площадь ДГ-зоны НАДФН-оксидазы уменьшена в 1,4 раза (р<0,05). нейтрофильный хроматин лейкоцит анемия
Активность фермента, количество клеток, в которых обнаружена положительная реакция на НАДФН-оксидазу, оптические и
геометрические параметры продукта цитохимической реакции у больных с острой постгеморрагической анемией не имели статистических отличий от значений в группе больных без анемии (р>0,05).
Статистический анализ выявил сильную прямую корреляционную связь между активностью миелопероксидазы в нейтрофилах крови и уровнем гемоглобина (rs=0,84). Связь между активностью НАДФН-оксидазы и уровнем гемоглобина крови имела среднюю силу. Увеличение показателей микроцитоза и гипохромии эритроцитов у больных с ЖДА сопровождалось снижением активности миелопероксидазы и НАДФН-оксидазы.
Не содержащие железо компоненты антибактериальных систем. Щелочная фосфатаза обнаружена в 81,8±6,6% нейтрофилов периферической крови у больных с легкой степенью ЖДА, что достоверно не отличается от процента реагирующих клеток у больных без анемии (р>0,05). Активность фермента составляет 4,56±0,5 отн.ед., а площадь ДГ-зоны продукта реакции в цитоплазме клеток - 40,8±2,6 мкм2, что не имет статистически значимых отличий от показателей в группе больных без анемии (р>0,05).
При средней степени ЖДА количество реагирующих клеток уменьшено в 1,6 раза - до 51,2±8,4% (р<0,05). Активность щелочной фосфатазы в нейтрофилах снижена в 2,7 раза (р<0,01), что сопровождается уменьшением площади ДГ-зоны в цитоплазме клеток в 2,1 раза (р<0,01), а оптической плотности продукта реакции - в 1,6 раза (р<0,05).
У больных с острой постгеморрагической анемией количество нейтрофильных лейкоцитов, в цитоплазме которых обнаружен продукт цитохимической реакции на щелочную фосфатазу, увеличено в 1,2 раза по сравнению с больными без анемии (р<0,05). Активность фермента выше в 1,4 раза (рис. 3В). Морфометрия изображения клеток показала увеличение площади ДГ-зоны щелочной фосфатазы в 1,4 раза (р<0,05).
Нафтол-AS-D-хлорацетат эстераза в нейтрофилах крови у больных с ЖДА легкой и средней степени тяжести обнаружена в 99,5±0,5 и 99,6±0,4% клеток, что статистически не отличается от процента реагирующих клеток у больных без анемии (р>0,05). Средние значения активности фермента, площади ДГ-зоны и оптической плотности продукта цитохимической реакции в цитоплазме нейтрофильных лейкоцитов при легкой и средней степени ЖДА не имеют статистически значимых отличий от показателей в группе больных без анемии (рис. 3Г).
При острой постгеморрагической анемии изменения в количестве реагирующих нейтрофилов, активности фермента, оптических и геометрических параметрах продукта цитохимической реакции в цитоплазме клеток статистически недостоверны (р>0,05).
Неферментные катионные белки. Количество клеток, содержащих катионные белки, у больных с легкой степенью ЖДА равно 99,8±0,2%. Содержание катионных белков в цитоплазме нейтрофилов составляет 5,12±0,3 отн. ед., а занимаемая площадь - 34,8±2,4 мкм2, что не отличается от показателей у больных без анемии (р>0,05).
При средней степени ЖДА количество нейтрофильных лейкоцитов в периферической крови, содержащих катионные белки, средние значения активности фермента и площади ДГ-зоны не имеют статистических отличий от показателей в группе больных без анемии (р>0,05).
В периферической крови больных с острой постгеморрагической анемией количество нейтрофилов, содержащих неферментные катионные белки, составило 99,2±0,8%. Содержание в цитоплазме клеток катионных белков - 5,26±0,6 отн.ед., что не имело статистически значимых отличий от показателей у больных без анемии (р>0,05). Компьютерная морфометрия изображения нейтрофильных лейкоцитов показала, что средняя площадь ДГ-зоны катионных белков и оптическая плотность продукта реакции статистически не отличаются от показателей в группе больных без анемического синдрома (р>0,05).
морфофункциональная характеристика ядер нейтрофильных лейкоцитов
Установлено, что нейтрофильные лейкоциты в периферической крови у больных с ЖДА содержат от 2 до 6 долей в ядре. Процент нейтрофилов с полисегментированными ядрами при легкой степени ЖДА выше в 2,1 раза, чем у больных без анемии (рис. 4). Индекс сегментации ядер нейтрофильных лейкоцитов равен 3,07±0,2 отн. ед., что статистически значимо отличается от показателя в группе больных без анемии (р<0,05).
При средней степени ЖДА количество нейтрофилов с полисегментированными ядрами в периферической крови выше в 2,3 раза (р<0,01). Индекс сегментации составляет 3,10±0,1 отн. ед., что статистически достоверно отличается от показателей в группе больных без анемии (р<0,05).
У больных с ЖДА между показателем полисегментации ядер нейтрофилов, индексом сегментации и гематологическими параметрами корреляционная связь отсутствует.
У больных с острой постгеморрагической анемией изменения в количестве полисегментированных нейтрофилов и среднем числе сегментов ядра статистически недостоверны (р>0,05).
Для оценки активационного потенциала ядер нейтрофильных лейкоцитов использовали показатель активности хроматина. Величина анизотропного эффекта отражает структурную упорядоченность ядерного хроматина, и снижение уровня анизотропии можно рассматривать как показатель, свидетельствующий о его деспирализации и диссоциации комплекса ДНК-гистон в ядрах нейтрофилов. Подобные явления указывают на возможное повышение матричной активности ДНК, а значит и на увеличение биосинтетической активности клеток (Евглевский А.А., 2000).
У больных с легкой степенью ЖДА количество нейтрофилов с анизотропным эффектом в ядре больше, чем у больных без анемии в 2 раза (р<0,01). Показатель активности ядерного хроматина составляет 1,79±0,3 отн.ед., что в 1,8 раза ниже по сравнению с больными без анемического синдрома (рис. 5 А, Б). При средней степени ЖДА количество клеток с анизотропным эффектом в ядре выше в 2,1 раза (р<0,01). Показатель активности хроматина нейтрофилов снижен до 1,91±0,1 отн.ед. (р<0,01).
У больных с острой постгеморрагической анемией анизотропный эффект обнаружен в ядрах 63,2±7,6% нейтрофилов, что статистически не отличалось от значений в группе больных без анемии (р>0,05). Изменение показателя активности хроматина в нейтрофильных лейкоцитах периферической крови при этом виде анемии также статистически недостоверно (рис. 4 А,Б).
Между количеством нейтрофилов с анизотропным эффектом в ядре и уровнем гемоглобина крови существует обратная корреляционная связь средней силы (rs=0,59). Увеличение показателей микроцитоза и гипохромии эритроцитов у больных с ЖДА сопровождается снижением количества клеток с анизотропными ядрами. Показатель активности ядерного хроматина нейтрофилов снижается при падении уровня гемоглобина в крови. Показатели микроцитоза и гипохромии прямо коррелируют с показателем активности ядерного хроматина нейтрофилов.
Увеличение интенсивности анизотропного эффекта в ядрах нейтрофильных лейкоцитов периферической крови у больных с ЖДА может свидетельствовать о выраженной конденсации ядерного хроматина и снижении его транскрипционной активности.
Результаты проведенного исследования показали, что нейтрофильные лейкоциты периферической крови у больных с ЖДА характеризуются структурно-цитохимическими изменениями в цитоплазматической зернистости и ядре. Изменение активности миелопероксидазы и НАДФН-оксидазы в нейтрофилах можно объяснить наличием железа в составе этих ферментов. Миелопероксидаза - гемопротеидный фермент азурофильной зернистости нейтрофильных лейкоцитов, механизм действия которого связан с каталитическими реакциями, протекающими при участии железа в составе гемового центра фермента (Abu-Soud H.M., Hazen S.L., 2000; Арнхольд Ю, 2004). НАДФН-оксидаза нейтрофильных лейкоцитов - мультиферментный комплекс. Её активность направлена на генерацию радикалов кислорода и связана с железосодержащим компонентом цитохромом b558 (Клебанов Г.И., Владимиров Ю.А., 1999; Ambruso D.R. et al., 2004). Таким образом, развивающаяся у больных с ЖДА сидеропения способствует снижению активности этих железосодержащих ферментов.