Определение групп крови может проводиться тремя способами:
- по стандартным изогемагглютинирующим сывороткам (редко)
- по стандартным отмымым эритроцитам с известной групповой принадлежностью (редко)
- с помощью моноклональных антител анти-А и анти-В (часто)
Определение групп крови по стандартным изогемагглютинирующим сывороткам
Суть метода сводится к обнаружению в испытуемой крови групповых антигенов А и В с помощью стандартных сывороток. Для этих целей используется реакция агглютинации.
Для проведения пробы необходимы:
- стандартные изогемагглютинирующие сыворотки групп I(0), II(A), III(B) двух различных серий (они должны быть четко промаркированы и помечены определенными цветами)
- белые фарфоровые или эмалированные тарелки или другие пластинки со смачиваемой поверхностью, маркированные, согласно группам крови.
- изотонический раствор хлорида натрия
- иглы, пипетки, стеклянные палочки (предметные стекла).
Техника проведения реакции.
1. Под соответствующими обозначениями группы крови на тарелку наносят сыворотку I, II, III групп в объеме 0,1 мл.
2. Кровь для исследований берут из пальца. Сухой стеклянной палочкой на пластину в 6 точек последовательно переносят 6 капель исследуемой крови величиной примерно с булавочную головку 0,01 мл, каждую рядом с каплей стандартной сыворотки. Затем их осторожно перемешивают между собой стеклянными палочками с закругленными краями.
3. Смешав капли, тарелку периодически покачивают. Агглютинация начинается в течение первых 10-30 секунд. Но наблюдение следует вести не менее 5 минут, так как возможна более поздняя агглютинация, например с эритроцитами группы А2 (II).
4. В те капли, где произошла реакция, добавляют по одной капле изотонического раствора хлорида натрия, после чего оценивают результаты реакции.
Реакция агглютинации может быть положительной или отрицательной
· При положительной реакции в течение первых 10-30 секунд наблюдают в смеси видимые невоору-женным глазом мелкие красные зернышки (агглютинаты), состоящие из склеенных эритроцитов.
· При отрицательной реакции капля остается равномерно окрашенной в красный цвет.
Если все сыворотки дали положительную реакцию, значит, испытуемая кровь содержит оба агглютиногена - А и В. Но в таких случаях, чтобы исключить неспецифическую реакцию агглютинации, следует провести дополнительное контрольное исследование испытуемой крови со стандартной сывороткой группы АВ (IV).
Определение групп крови с помощью моноклональных антител анти-А и анти-В (цоликлоны анти-А и анти-В)
Цоликлоны анти-А и анти-В применяют для определения группы крови человека по системе АВ0 путем выявления антигенов А и В в эритроцитах стандартными антителами, содержащимися в цоликлонах.
Техника проведения:
· Цоликлоны анти-А и анти-В наносят на белый планшет по одной большой капле (0,1 мл) под соот-ветствующими надписями: анти-А или анти-В. Рядом с каплями антител следует нанести по одной маленькой капле исследуемой крови. После перемешивания компонентов наблюдают за реакцией агг-лютинации в течение 2-3 минут. После оценивают результаты
· Возможны следующие варианты реакции агглютинации:
- агглютинация отсутствует с цоликлонами анти-А и анти-В, значит кровь не содержит агглютиногенов А и В – исследуемая крови I(0) группы
- агглютинация наблюдается с цоликлонами анти-А, значит эритроциты содержат агглютиноген А – исследуемая кровь группы II(A)
- агглютинация наблюдается с цоликлонами анти-В, значит эритроциты содержат агглютиноген В – исследуемая кровь группы III(B)
- агглютинация наблюдается с цоликлонами анти-А и анти -В, значит эритроциты содержат агглютиногены А и В – исследуемая кровь группы IV(A, B)
· В четвертом случае для исключения неспецифической агглютинации производят дополнительное исследование с изотоническим раствором хлорида натрия. Большую каплю изотонического раствора смешивают с маленькой каплей крови. Отсутствие агглютинации подтверждает принадлежность исследуемой крови к IV(A,B) группе
Определение группы крови по стандартным отмытым эритроцитам с известной групповой принадлежностью
- из вены берут 3-4мл крови и центрифугируют
- на тарелку, разделенную на секторы, наносят по капле сыворотки, к которой добавляют каплю стандартных эритроцитов (в 5 раз меньше капли сыворотки), перемешивают углом предметного стекла покачивают тарелку около 3 минут
- добавляют по капле изотонического раствора NaCl, продолжают смешивать и через 5 минут оценивают результат
Возможные результаты:
1. Агглютинация отсутствует с эритроцитами I(0) группы и определяется с эритроцитами II(a) и III(B) групп – исследуемая кровь I(0) группы
2. Агглютинация отсутствует с эритроцитами I(0) и II(A) групп и определяется с эритроцитами III(B) группы – исследуемая кровь II(А) группы
3. Агглютинация отсутствует с эритроцитами I(0) и III(B) групп и определяется с эритроцитами II(А) группы – исследуемая кровь III(B) группы
4. Агглютинация отсутствует с эритроцитами I(0), II(A), III(B) групп – исследуемая кровь IV(A, B) группы
Система Rh-фактора представлена шестью антигенами (D, d, C, c, E, e). У 85% людей в эритроцитах встречается Rh-антиген D (наиболее активный в антигенном отношении), этих людей считают резус-положительными. 15% людей относятся к резус-отрицательным – в их эритроцитах этого антигена нет. Если в кровь резус-отрицательного человека попадает Rh-антиген, в его организме вырабатываются антитела к Rh-фактору. При повторном попадании антигена в кровь уже сенсибилизированного человека развивается иммунный конфликт. У реципиента это может проявляться гемотрансфузионной реакцией, вплоть до шока, а у беременных иожет привести к смерти плода и выкидышу или рождению ребенка, страдающего гемолитической болезнью.
Определение Rh-фактора
Исследование крови на резус-принадлежность методом конглютинации проводят с помощью специальных сывороток анти-Rh в лабораторных условиях. Предварительно определяют групповую принадлежность (по системе АВ0).
Оснащение:
- две различные серии стандартных сывороток анти-Rh, соответствующих групповой принадлежности определяемой крови
- чашка Петри
- водяная баня
- пипетки для сывороток
- предметные стекла или стеклянные палочки
Методика проведения:
· На чашку Петри наносят подряд три большие капли сыворотки анти-Rh одной серии и параллельно – три капли сыворотки другой серии
· В первый вертикальный ряд (капли обеих серий) вносят по небольшой каплеисследуемой крови, в средний ряд – по такой же капле стандартных резус-положительных эритроцитов (для контроля активности), в третий ряд – резус-отрицательных эритроциты (контроль специфичности)
· Стеклянными палочками или углами предметных стекол в каждой капле перемешивают сыворотку и эритроциты
· Чашки закрывают и помещают на водяную баню при температуре 46-48⁰С на 10 минут и затем оценивают результат
Результаты:
- в капле со стандартными резус-положительными эритроцитами должна быть агглютинация, с резус-отрицательными – она отсутствует
- если в каплях обеих серий сывороток с исследуемыми эритроцитами определяется агглютинация – кровь резус-положительная, если она отсутствует – кровь резус-отрицательная
Экспресс-метод: для него используется специальный реагент – сыворотка анти-Rh IV(A,B) группы, разведенная 20-30% раствором альбумина человека или 30-33% раствором декстрана (вещество, способствующее агрегации эритроцитов при комнатной температуре).
Методика:
- каплю специальной сыворотки наносят на предметное стекло или чашку Петри и параллельно вносят каплю резус-отрицательной сыворотки IV(A,B) группы, не содержащей антител
- к ним добавляют в 2-3 раза меньшего объема каплю исследуемой крови, перемешивают и покачивают в течении 3-4 минут, после чего добавляют по 1 капле изотонического раствора хлорида натрия
- через 5 минут оценивают результат
Результат:
1. При наличии агглютинации эритроцитов с сывороткой анти-Rh и отсутствии ее с контрольной сывороткой – кровь резус-положительная
2. При отсутствии агглютинации с обеими сыворотками – кровь резус-отрицательная
Значение групповой принадлежности при гемотрансфузии
Группа крови каждого человека включает большое количество различных эритроцитарных, лейкоцитарных, тромбоцитарных и плазменных антигенов, достаточно активных и способных стать причиной иммунологической несовместимости при гемотрансфузии. Главенствующую роль играют антигенные системы АВ0 и Rh-фактора.
Иммунологическая несовместимость возникает при появлении в результате гемотрансфузии в крови у реципиента одноимённых антигенов в эритроцитах и в достаточном количестве антител - в сыворотке крови (агглютиноген А - агглютинин а; агглютиноген В - агглютинин β; антиген D(Rh0) - антирезусные антитела). При этом возникает агглютинация эритроцитов с последующим гемолизом.
Первыми указали на значение групповой совместимости крови донора и реципиента, как на важнейшее условие «приживления» перелитой крови, Грилле (1907) и Оттенберг (1908).
Правило Оттенберга
При выявлении совместимости крови реципиента и донора по системе АВ0 Оттенберг ввёл правило (правило Оттенберга), согласно которому подвергаются агглютинации только эритроциты переливаемой донорской крови, так как агглютинины вливаемой крови разводятся в сосудистом русле пациента, их титр становится низким и они не в состоянии агглютинировать эритроциты реципиента. По правилу Оттенберга, можно переливать кровь, эритроциты которой не могут быть агглютинированы сывороткой реципиента. В соответствии с правилом Оттенберга возможно переливание не только одногруппной крови.
Правило Оттенберга применимо лишь при переливании до 0,5 л донорской крови!
Особенность совместимости по резус-фактору
В норме в крови как резус-положительных, так и резус-отрицательных людей антирезусных антител нет. Причины их появления в сыворотке резус-отрицательных людей следующие:
• резус-конфликт при беременности;
• переливание резус-положительной крови (схема такая же, как и при резус-конфликте)
Резус-конфликт
Система резус-фактора играет большую роль в акушерстве и гинекологии. Во время беременности резус-отрицательной женщины резус-положительным плодом может происходить иммунизация беременной и образование у неё антител анти-D, которые из её крови проникают через плацентарный барьер, попадают в кровоток плода и повреждают его резус-положительные эритроциты и органы кроветворения. Возникает резус-конфликт. Указанные изменения ведут к развитию гемолитической болезни, имеющей симптомы различной степени выраженности: от анемии, выраженной желтухи и отёка плода до нарушения беременности и мертворождения.
Первая беременность, как правило, заканчивается рождением здорового ребёнка, происходит только сенсибилизация матери к антигену D. В последующем, если снова развивается резус-положитель- ный плод, тяжесть проявления и последствий резус-конфликта нарастает.
Современные правила переливания крови
Современные достижения иммуногематологии и клиническая практика показали, что при переливании крови универсального донора реципиентам других групп возможен гемолиз эритроцитов реципиента не только за счёт естественных антител (при массивной гемотрансфузии), но и особыми антителами (анти-А и реже анти-В). Эти антитела образуются у универсальных доноров при иммунизации антигенами A и B во время беременности, вакцинации и т.д.
Переливание резус-отрицательной крови резус-положительному реципиенту может привести к образованию антител на слабые антигены системы резус (С и E).
В связи с этим в настоящее время необходимо переливать только одногруппную (по системе АВ0) и однорезусную кровь!
Только в исключительных случаях - при жизненных показаниях к гемотрансфузии и невозможности определить группу крови больного или при отсутствии одногруппной донорской крови - допустимо использование крови универсального донора в количестве до 500 мл. Детям переливание любой крови, кроме одногруппной, запрещено!
Основные антигенные системы крови
Под антигенной системой понимают совокупность антигенов крови, наследуемых (контролируемых) аллельными генами. Все антигены крови делят на клеточные и плазменные. Основное значение в трансфузиологии имеют клеточные антигены.
Клеточные антигены
Клеточные антигены - сложные углеводно-белковые комплексы (гликопептиды), структурные компоненты мембраны клеток крови. От других компонентов клеточной мембраны они отличаются иммуногенностью и серологической активностью.
Иммуногенность - способность антигенов индуцировать синтез антител, если они попадают в организм, у которого эти антигены отсутствуют. Серологическая активность - способность антигенов соединяться с одноимёнными антителами.
Молекула клеточных антигенов состоит из двух компонентов:
- шлеппер (белковая часть антигена, расположенная во внутренних слоях мембраны), определяющий иммуногенность;
- гаптен (полисахаридная часть антигена, расположенная в поверхностных слоях клеточной мембраны), определяющий серологическую активность.
На поверхности гаптена расположены антигенные детерминанты (эпитопы) - молекулы углеводов, к которым присоединяются антитела. Известные антигены крови отличаются друг от друга эпитопами. Например, гаптены антигенов системы АВ0 имеют следующий набор углеводов: эпитоп антигена 0 - фукоза, антигена А - N-ацетилгалактозамин, антигена В - галактоза. С ними и соединяются групповые антитела.
Различают три вида клеточных антигенов:
- эритроцитарные;
- лейкоцитарные;
- тромбоцитарные.
Эритроцитарные антигены
Известно более 250 антигенов эритроцитов, образующих свыше 20 антигенных систем. Клиническое значение имеет 11 систем: АВ0, Резус (Rh), MNSs, Келл, Лютеран, Кидд, Диего, Даффи, Домброк, ферментные группы эритроцитов.
У человека в эритроцитах присутствуют одновременно антигены нескольких антигенных систем.
Основными в трансфузиологии признаны антигенные системы АВ0 и Резус. Другие антигенные системы эритроцитов в настоящее время существенного значения в клинической трансфузиологии не имеют.
Антигенная система АВ0
Система АВ0 - основная серологическая система, определяющая совместимость или несовместимость переливаемой крови. Её составляют два генетически детерминированных агглютиногена (антигены А и В) и два агглютинина (антитела α и β).
Агглютиногены А и В содержатся в строме эритроцитов, а агглютинины α и β - в сыворотке крови. При встрече одноимённых антигенов и антител возникает реакция изогемагглютинации. Именно эта реакция - причина несовместимости крови при гемотрансфузии.
В зависимости от сочетания в эритроцитах антигенов А и В (и соответственно в сыворотке антител α и β) всех людей разделяют на четыре группы.
Антигенная система Резус
Резус-фактор (Rh-фактор), названный так вследствие того, что впервые был обнаружен у макак резус, присутствует у 85% людей, а у 15% отсутствует.
В настоящее время известно, что система Резус достаточна сложна и представлена шестью антигенами. Роль резус-фактора при гемотрансфузии, а также при беременности крайне велика. Ошибки, приводящие к развитию резус-конфликта, вызывают тяжёлые осложнения, а иногда и смерть больного.
Лейкоцитарные антигены
В мембране лейкоцитов существуют антигены, аналогичные эритроцитарным, а также специфичные для этих клеток антигенные комплексы, называемые лейкоцитарными антигенами. Впервые сведения о лейкоцитарных группах получил французский исследователь Ж. Доссе в 1954 г. Первым был выявлен антиген лейкоцитов, встречающийся у 50% европейского населения. Этот антиген был назван «Мак». В настоящее время насчитывают около 70 антигенов лейкоцитов, их разделяют на три группы:
• общие антигены лейкоцитов (HLA - Human Leucocyte Antigen);
• антигены полиморфно-ядерных лейкоцитов;