Учреждение образования
«БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»
Факультет лесохозяйственный
Кафедра ландшафтного проектирования и садово-паркового строительства
Специальность 1-75 81 01
«Ландшафтное
проектирование и строительство»
РЕФЕРАТ
по дисциплине «Интенсивное ведение отрасли садоводства и декоративного растениеводства»
Тема «Метод
клонального микроразмножения в декоративном растениеводстве»
Исполнитель: магистрант М.В. Козлова
Руководитель
кандидат с.-х. наук
ст. преподаватель каф. ЛП и СПС
С.А.
Праходский
Минск
2015
Введение
Одна из особенностей живых организмов - способность к размножению. Существует два основных способа размножения: половое и бесполое. Для каждого из них характерно значительное разнообразие форм. Половое - это размножение, при котором новый организм развивается из зиготы, образующейся в результате оплодотворения, т. е. слияния ядер мужской и женской половых клеток.
Вегетативное размножение - образование нового организма из части материнского. Таким образом могут размножаться микроорганизмы, почти все растения и некоторые животные (губки, мшанки, кишечнополостные, простейшие).
Бесполое размножение - характеризуется отсутствием полового процесса; такое размножение свойственно одноклеточным и многоклеточным растительным и животным организмам.
Термин «клон» (по гречески klon - черенок) был предложен в 1903 г А. Веббером для вегетативно размножаемых растений. Он установил, что отпрыски растения, размножаемого неполовым путем, лишь части (клоны) материнской особи, идентичные как с ней, так и между собой. Клонирование подразумевает организмы, полученные из единичных клеток посредством митотических делений [1].
Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения - клонального микроразмножения. В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, т. е. под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму.
Главное предназначение системы производства посадочного материала создание долголетних, ежегодно плодоносящих, удобных в эксплуатации, быстро окупающихся и стабильно приносящих прибыль, адаптированных к местным природно-климатическим и рыночным условиям насаждений плодовых и ягодных культур. Известно, что потребность растениеводства в посадочном материале в последние 10-15 лет увеличивается, кроме того, в последнее время возросла потребность в оздоровленном посадочном материале, что связано с широким распространением вирусных, фитоплазменных и грибных заболеваний. Однако в полевых условиях не существует эффективных приемов массового оздоровления многолетних растений. В настоящее время в ряде стран Европы и Америки уже невозможно представить систему производства оздоровленного посадочного материала без широкого использования методов культуры изолированных тканей. Применение биотехнологических приемов позволяет:
) получить посадочный материал, свободный от грибных, фитоплазменных и вирусных заболеваний, за короткое время и в достаточном количестве;
) быстро размножить ценный клон растения (сорт);
) получить в большом количестве вегетативное потомство трудноразмножаемых в обычных условиях сортов и форм растений;
) работать в лабораторных условиях круглый год и планировать выпуск растений к определенному сроку;
) длительно сохранять растительный материал в условиях in vitro, а также обменивать его в международном масштабе без риска заражения карантинными вредителями и болезнями;
) получать растения с измененной плоидностью и трансгенные растения.
Сейчас технологии клонального микроразмножения in vitro на лабораторном уровне разработаны в мире более чем для 2400 видов растений. Однако коммерческих лабораторий, использующих эти приемы, относительно немного, не считая тех, которые занимаются орхидеями. Это объясняется отчасти тем, что не все, разработанные в сугубо лабораторных условиях методики, применимы непосредственно в производстве. Часто требуется решение отдельных узловых моментов для конкретных видов растений. Немаловажным является и вопрос экономической эффективности.
Область применения микроразмножения разнообразна
и имеет тенденцию постоянно расширяться. Это в первую очередь относится к
размножению in vitro картофеля, плодовых, ягодных, декоративных, лесных
растений [2].
1. Сущность, основные преимущества клонального
микроразмножения, области его применения
Микроклональное размножение растений - один из способов вегетативного размножения в условиях «in vitro».
Для семенных растений <https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%A1%D0%B5%D0%BC%D0%B5%D0%BD%D0%BD%D1%8B%D0%B5_%D1%80%D0%B0%D1%81%D1%82%D0%B5%D0%BD%D0%B8%D1%8F> характерно два способа размножения <https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%A0%D0%B0%D0%B7%D0%BC%D0%BD%D0%BE%D0%B6%D0%B5%D0%BD%D0%B8%D0%B5>: семенной <https://ru.wikipedia.org/w/index.php?title=%D0%A1%D0%B5%D0%BC%D0%B5%D0%BD%D0%BD%D0%BE%D0%B5_%D1%80%D0%B0%D0%B7%D0%BC%D0%BD%D0%BE%D0%B6%D0%B5%D0%BD%D0%B8%D0%B5&action=edit&redlink=1> и вегетативный. Оба эти способа имеют как преимущества, так и недостатки. К недостаткам семенного размножения следует отнести, в первую очередь, генетическую пестроту получаемого посадочного материалa <https://ru.wikipedia.org/w/index.php?title=%D0%9F%D0%BE%D1%81%D0%B0%D0%B4%D0%BE%D1%87%D0%BD%D1%8B%D0%B9_%D0%BC%D0%B0%D1%82%D0%B5%D1%80%D0%B8%D0%B0%D0%BB&action=edit&redlink=1> и длительность ювенильного периода <https://ru.wikipedia.org/w/index.php?title=%D0%AE%D0%B2%D0%B5%D0%BD%D0%B8%D0%BB%D1%8C%D0%BD%D1%8B%D0%B9_%D0%BF%D0%B5%D1%80%D0%B8%D0%BE%D0%B4&action=edit&redlink=1>. При вегетативном размножении сохраняется генотип <https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%93%D0%B5%D0%BD%D0%BE%D1%82%D0%B8%D0%BF> материнского растения и сокращается продолжительность ювенильного периода. Однако для большинства видов <https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%91%D0%B8%D0%BE%D0%BB%D0%BE%D0%B3%D0%B8%D1%87%D0%B5%D1%81%D0%BA%D0%B8%D0%B9_%D0%B2%D0%B8%D0%B4> (в первую очередь для древесных пород <https://ru.wikipedia.org/w/index.php?title=%D0%94%D1%80%D0%B5%D0%B2%D0%B5%D1%81%D0%BD%D1%8B%D0%B5_%D0%BF%D0%BE%D1%80%D0%BE%D0%B4%D1%8B&action=edit&redlink=1>) проблема вегетативного размножения остается до конца не решенной. Это обусловлено следующими причинами:
не все породы, даже на ювенильной стадии, могут размножаться вегетативным способом с требуемой эффективностью (дуб <https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%94%D1%83%D0%B1>, сосна <https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%A1%D0%BE%D1%81%D0%BD%D0%B0>, ель <https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%95%D0%BB%D1%8C>, орехоплодные <https://ru.wikipedia.org/w/index.php?title=%D0%9E%D1%80%D0%B5%D1%85%D0%BE%D0%BF%D0%BB%D0%BE%D0%B4%D0%BD%D1%8B%D0%B5&action=edit&redlink=1> и др.);
практически невозможно с помощью черенкования <https://ru.wikipedia.org/w/index.php?title=%D0%A7%D0%B5%D1%80%D0%B5%D0%BD%D0%BA%D0%BE%D0%B2%D0%B0%D0%BD%D0%B8%D0%B5&action=edit&redlink=1> размножать многие виды древесных пород в возрасте старше 10-15 лет;
не всегда удается получать стандартный посадочный материал (возможность накопления и передачи инфекции);
трудоемкостью и сложностью операций при размножении взрослых (древесных) растений с помощью прививок <https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9F%D1%80%D0%B8%D0%B2%D0%B8%D0%B2%D0%BA%D0%B0_%28%D0%B1%D0%BE%D1%82%D0%B0%D0%BD%D0%B8%D0%BA%D0%B0%29>;
неэффективностью разработанных технологий для получения достаточного количества генетически однородного материала в течение года.
Обязательное условие клонального микроразмножения - использование объектов, полностью сохраняющих генетическую стабильность на всех этапах процесса, от экспланта до растений в поле. Такому требованию удовлетворяют стеблевые апексы и пазушные почки органов стеблевого происхождения, т. е. меристематические ткани. Их устойчивость к генетическим изменениям, вероятно, связана с высокой активностью систем репарации ДНК, а также негативной селекцией изменённых клеток.
Для получений клонов можно использовать любую клетку, ткань или орган растения. Вызывая последовательно дедифференцировку клеток экспланта и вторичную дифференцировку каллусных клеток, можно добиться регенерации растения. Однако проще и удобнее использовать для клонирования меристематические ткани, так как они обладают генетической стабильностью и позволяют получать оздоровленные растения. Реализовать тотипотентность in vitro можно индукцией в каллусных тканях или культивируемых клетках цепи событий. Это образование меристематических очагов, развитие на их основе стеблевых апексов; появление побегов, которые после укоренения развиваются в целое растение (индукция побегов).
Метод микроклонального размножения, несомненно, имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения:
получение генетически однородного посадочного материала;
освобождение растений от вирусов <https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%92%D0%B8%D1%80%D1%83%D1%81> за счет использования меристемной культуры <https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9C%D0%B5%D1%80%D0%B8%D1%81%D1%82%D0%B5%D0%BC%D0%B0>;
высокий коэффициент размножения (105-106 - для травянистых <https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%A2%D1%80%D0%B0%D0%B2%D1%8F%D0%BD%D0%B8%D1%81%D1%82%D1%8B%D0%B5_%D1%80%D0%B0%D1%81%D1%82%D0%B5%D0%BD%D0%B8%D1%8F>, цветочных растений <https://ru.wikipedia.org/w/index.php?title=%D0%A6%D0%B2%D0%B5%D1%82%D0%BE%D1%87%D0%BD%D1%8B%D0%B5_%D1%80%D0%B0%D1%81%D1%82%D0%B5%D0%BD%D0%B8%D1%8F&action=edit&redlink=1>, 104-105 - для кустарниковых <https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9A%D1%83%D1%81%D1%82%D0%B0%D1%80%D0%BD%D0%B8%D0%BA%D0%B8> древесных, 104 - для хвойных <https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%A5%D0%B2%D0%BE%D0%B9%D0%BD%D1%8B%D0%B5_%D1%80%D0%B0%D1%81%D1%82%D0%B5%D0%BD%D0%B8%D1%8F>);
сокращение продолжительности селекционного процесса <https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%A1%D0%B5%D0%BB%D0%B5%D0%BA%D1%86%D0%B8%D1%8F> и возможность размножить уникальные формы за 2 - 3 года вместо 10-12 лет, необходимых при обычных подходах;
ускорение перехода растений от ювенильной к репродуктивной <https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%A0%D0%B5%D0%BF%D1%80%D0%BE%D0%B4%D1%83%D0%BA%D1%82%D0%B8%D0%B2%D0%BD%D0%B0%D1%8F_%D1%81%D0%B8%D1%81%D1%82%D0%B5%D0%BC%D0%B0> фазе развития;
размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;
возможность проведения работ в течение года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала
возможность автоматизации процесса выращивания [4].
сохрание редких видов растений орхидеи <#"864716.files/image001.gif">
Рисунок 1 - Активация развития уже существующих
в растении меристем, основывающаяся на снятии апикального доминирования: 1
-снятие апикального доминирования и последующее микрочеренкование побега in
vitro на безгормоналыюй среде; 2 - индуцированное развитие многочисленных
пазушных побегов под действием веществ цитокининового типа действия
Этого можно достичь двумя путями: а) удалением верхушечной меристемы стебля и последующим микрочеренкованием побега in vitro на безгормональной среде; б) добавлением в питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих развитие многочисленных пазушных побегов. Как правило, в качестве цитокининов используют 6-бензиламинопурин (БАП) или 6-фурфуриламинопурин (кинетин) и зеатин.
Полученные таким образом побеги отделяют от первичного экспланта и вновь самостоятельно культивируют на свежеприготовленной питательной среде, стимулирующей пролиферацию пазушных меристем и возникновение побегов более высоких порядков.
Часто в качестве экспланта используют верхушечные или пазушные почки, которые изолируют из побега и помещают на питательную среду с цитокининами. Образующиеся пучки побегов делят, при необходимости черенкуют и переносят на свежую питательную среду. После нескольких пассажей, добавляя в питательную среду ауксины, побеги укореняют in vitro.
В настоящее время этот метод широко используется в производстве безвирусного посадочного материала сельскохозяйственных культур, таких как технические (сахарная свекла, хмель, табак, топинамбур, стахис) и овощные (томаты, картофель, огурец, перец, тыква, спаржа и др.), а также для размножения культур промышленного цветоводства (гвоздика, хризантема, роза, гербера), тропических и субтропических растений (рододендрон, азалия, камелия, чай и др.), плодовых и ягодных культур (яблоня, слива, вишня, груша, виноград, малина, смородина, крыжовник и др.) и древесных растений (тополь, ива, ольха, береза, рябина, секвойя, туя, можжевельник и др.)
Для некоторых культур, таких как картофель, технология клонального размножения поставлена на промышленную основу. Применение метода активации развития существующих меристем позволяет получать из одной меристемы картофеля более 100000 растений в год, причем технология предусматривает получение в пробирках микроклубней - ценного безвирусного семенного материала [3-5].
Второй метод - индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями экспланта. Он основан на способности изолированных частей растения при благоприятных условиях питательной среды восстанавливать недостающие органы и таким образом регенерировать целые растения. Можно добиться образования адвентивных почек почти из любых органов и тканей растения (изолированного зародыша, листа, стебля, семядолей, чешуек и донца луковиц, сегментов корней и зачатков соцветий). Этот процесс происходит на питательных средах, содержащих цитокинины в соотношении с ауксинами 10:1 или 100:1. В качестве ауксина используют ИУК или НУК.
Это наиболее распространенный метод микроразмножения высших растений, которым были размножены многие луковичные цветочные растения (нарциссы, лилии, гиацинты, гладиолусы, тюльпаны) из луковичных чешуи, сегментов базальной части донца луковиц, эксплантов листьев; представители рода Бразика (капуста цветная, кочанная, брюссельская, листовая, брокколи) - из сегментов гипокотиля, котиледона, листьев; лук, чеснок - из верхушечной меристемы, ткани донца луковиц; томаты - из апикальных или пазушных меристем; салат цикорный - из сегментов листовых пластинок; петуния - из сегментов корней; глоксиния, сенполия, стрептокарпус, эшинапсус - из сегментов листовых пластинок, а также некоторые представители древесных растений - из изолированных зрелых и незрелых зародышей.
Несомненный интерес вызывает вопрос, связанный с происхождением адвентивных почек, в частности, какие клеточные слои участвуют в дифференциации меристем. Единого мнения по этому вопросу пока нет. Так, Тран Тан Ван в своих работах с тканями табака установила, что именно эпидермис является наиболее активной тканью, способной образовывать почки, каллус или корни в зависимости от гормонального баланса питательной среды.
Цитологические исследования, проведенные на сегментах базальной части донца луковиц тюльпанов и нарциссов, показали, что адвентивные побеги формируются из поверхностных слоев меристематических клеток, прилегающих к донцу, а для растений глоксинии, сенполии и стрептокарпуса процесс формирования адвентивных почек, как правило, происходит в субэпидермальных клеточных слоях листовых пластинок.
Единого мнения по этому вопросу также нет и среди исследователей, работающих с древесными растениями. Так, Арнольд и Эрихсон, Джонсон и Борнмап считают, что образование почек на изолированной хвое ели обыкновенной под действием БАП и 2ip происходит в эпидермальном слое культивируемого экспланта, по мнению Чин и Ченга, для псевдотсуги - в субэпидермальных слоях; а Вилалобос и другие утверждают, что при культивировании семядолей сосны замечательной на среде, содержащей один цитокинин, этот процесс происходит одновременно в эпидермальном и субэпидермальном слоях. Для сосны обыкновенной также было отмечено образование адвентивных почек в эпидермальном и субэпидермальном слоях семядолей зародыша. Этот процесс для сосны не зависит от применяемых цитокининов [3-5].
Третий метод, практикуемый при клональном микроразмножении, основывается на дифференциации из соматических клеток зародышеподобных структур, которые по своему виду напоминают зиготические зародыши. Этот метод получил название соматического эмбриогенеза. В отличие от развития in vivo, соматические зародыши развиваются асексуально вне зародышевого мешка и по своему внешнему виду напоминают биполярные структуры, у которых одновременно наблюдается развитие апикальных меристем стебля и корня. Согласно Стеварду, соматические зародыши проходят 3 стадии развития: глобулярную, сердцевидную, торпедовидную и в конечном итоге имеют тенденцию развития в проросток.