Реферат: Метод клонального микроразмножения в декоративном растениеводстве

Таблица 2- Среда Гамборга (B5)

Последовательность приготовления питательных сред для растительных клеток.

Составление питательной среды начинают с приготовления концентрированных (маточных) растворов. Для удобства готовят маточные растворы, чтобы не взвешивать все необходимые соли всякий раз, когда вздумается завести культуру. С другой стороны, концентрированные растворы менее подвержены опасности быть съеденными микроорганизмами, которая существует даже при хранении разбавленных растворов в холодильнике. Ведь соленые огурцы у вас хранятся гораздо дольше, чем свежие.

Вторая причина, по которой готовят маточные растворы - снижение погрешности при отмеривании необходимого количества солей. Согласитесь, взвесить 5 граммов проще, чем 50 миллиграмов - во всяком случае мерную емкость, которой потом можно будет отмерить 5, 10 или 20 миллилитров найти проще, чем аналитические весы.

Обычно готовят несколько маточных растворов - макроэлементы, хелатное железо, микроэлементы, хлористый кальций, витамины, хранят их в отдельных колбах, а при приготовлении среды сливают в той последовательности, в какой они перечислены выше. Делается это для того, чтобы при взаимодействии солей не происходило образование осадка.

Макросоли взвешивают на технических весах, растворяют по отдельности в небольшом количестве бидистиллята и доводят в цилиндре до объема, в 10 меньшего, чем требуется по прописи среды, т.е. на 1 литр общего объема питательной среды берут 100 мл раствора макросолей. Иногда эта пропорция изменяется, и концентрация увеличивается не в 10 раз, а более, соответственно меняется и объем маточного раствора, который берется для приготовления 1 литра питательной среды.

Например, если мы готовим 1 литр (1000 мл) маточного раствора, увеличивая концентрацию солей в нем в 20 раз (масса навески каждой соли * 20), то для приготовления среды берется 50 мл такого концентрированного раствора (как в случае среды Мурасиге-Скуга). Таким образом, в этим 1 литре маточного раствора у нас 20 порций по 50 мл для приготовления 20 сред (20*50=1000). Если концентрация увеличивается в 25 раз, то берется 40 мл и т.д.

Навески микросолей для хелатного железа растворяют по отдельности, смешивают и доводят до объема с конечной концентрацией 50 мл/л. Раствор должен получится ярко-желтого цвета, рН 8.0. Неправильное приготовление хелатного железа может привести к выпадению в осадок после автоклавирования фосфатов кальция или магния.

Навески микроэлементов взвешивают на аналитических весах, растворяют так, чтобы конечная концентрация соответствовала 5 мл раствора на 1 литр готовой среды, то есть для приготовления питательной среды мы будем брать по 5 миллилитров.

Полученные растворы сливают в склянки с притертыми крышками, снабжают этикеткой и хранят в холодильнике. Железо-хелатный комплекс хранят в темной склянке.

Витамины готовить несколько сложнее. Самая большая проблема - правильно определить, сколько же граммов или миллиграммов искомого вещества может содержать капсула с витамином. Обычно на коробочке пишут 1%, 5%, 6% раствор тиамин-хлорида, никотиновой кислоты или другого необходимого вам витамина. Это означает, что для его приготовления 1% раствора было взято 1000 миллиграмм вещества, которые растворили в 100 мл воды. Следовательно, каждый миллилитр этого раствора содержит 10 миллиграмов витамина. Стандартная аптечная расфасовка - капсулы по 1 миллилитру. Значит, в каждой капсуле содержится 10 миллиграммов витамина, если это 1% раствор, 50 мг - если 5%. Если вам требуется 10 миллиграммов определенного витамина, а вы имеете в распоряжении капсулу объемом 1 мл, содержащую 50 мг вещества, то что вы сделаете? Правильно - добавите содержимое этой капсулы в мерный цилиндр, доведете объем до 50 мл (лучше всего вытянуть раствор из капсулы шприцем и потом несколько раз промыть дистиллятом и шприц, и капсулу, сливая воду в цилиндр, где вы производите разбавление. И уже разведенного раствора вы возьмете 10 миллилитров. Витамины разливают по 5 мл в пенициллиновые флакончики или пробирки, ставят в морозилку и хранят в замороженном виде. Концентрированные растворы готовят с расчетом добавления 5 мл на 1 литр среды. При составлении среды флакончик с витаминами достают из холодильника, размораживают, опуская в горячую воду, и выливают в колбу с питательной средой.

Фитогормоны (ауксины и цитокинины) сначала растворяют в 2 мл 96oC этилового спирта (или 0.1 н NaCl) и добавляют 98 мл воды, доводя объем до 100 мл, хранят при температуре 2-4оС. Гиббереллин легко растворим в воде.

Необходимую навеску агар-агара растворяют 300 мл дистиллированной воды (можно при подогревании), добавляют сухие органические компоненты, перемешивают.

С помощью мерного цилиндра и пипеток отбирают маточные растворы макросолей, микроэлементов, хелатного железа, гормонов, витаминов и переносят их в колбу на 1 литр с уже растворенным агаром, доводят рН до необходимого значения с помощью 0.1 н NaOH или HCl.

Колбы или пробирки закрывают ватными пробками, накрывают целлофаном и затягивают резинкой. Можно закрывать плотной фольгой вместо пробок. Если нет целлофана, то перед автоклавированием пробирки или колбы закрываются сверху крафтовой бумагой.

Автоклавированную среду, содержащую ауксины, лучше использовать сразу; если среду необходимо хранить продолжительное время, её помещают в холодильник при 2-4оС.

Некоторые фитогормоны, например гибберелловую кислоту и зеатин, а также аминокислоты автоклавировать нельзя по причине их термолабильности. В таких случаях среду готовят без этих веществ, автоклавируют, охлаждают до 50оС, в стерильных условиях добавляют термолабильный компонент, пропущенный через бактерицидный фильтр с размером пор 0.22 мкм, разливают по пробиркам и колбам [8].

Размножение растений клоновым способом может производиться в отдельных шариках питательной среды.

Заводить и вести культуру растительных клеток гораздо проще.

Растительные культуры поддерживают при температурах от 22 до 27оС, в темноте или при освещении. Среды для них - несложные, и их легко приготовить самому. Культивировать можно на твердых питательных средах с добавлением агар-агара, крахмала или на жидких питательных средах, с использованием мостиков из ваты и фильтровальной бумаги.

Когда проводили работы по селекции каллусов на среде с ПЭГ (очень сильный осмотик, имитирующий засуху в этих экспериментах), то столкнулись с проблемой - агар в присутствии высоких концентраций полиэтиленгликоля не застывал после автоклавирования. Выход был найден - на дно пробирок или баночек клали комочек ваты (рыхлый), сверху - вырезанный по диаметру сосуда кусочек фильтровальной бумаги, заливали жидкой питательной средой так, чтобы ее уровень не превышал 1 мм над поверхностью бумаги. Высота столбика среды в пробирке диаметром 2 см - примерно 1-1,5 см, в баночке из под детского питания - 0,5 см.

Суспензионные культуры растительных клеток поддерживать гораздо сложнее - необходима мешалка для постоянного перемешивания среды. Иначе эксплант погибнет, в первую очередь, от отсутствия доступа кислорода.

Условия освещения различны в зависимости от поставленных вами задач. Каллусную ткань обычно получают в темноте. Клональное микроразмножение проводят при освещении. В качестве источника света лучше пригодны лампы дневного света. Они не нагревают камеру и имеют более или менее подходящий для растений спектральный состав света.

. Факторы, влияющие на процесс клонального микроразмножения

На эффективность микроклонального размножения влияет масса факторов различной природы. Это физиологические особенности вводимого в культуру растения, химические и физические условия культивирования. Наиболее важным моментом является выбор материнского растения и экспланта.

При выборе материнского растения необходимо учитывать его физиологические, сортовые и видовые особенности. Исходные растения должны быть здоровы, не поражены грибными, бактериальными и вирусными болезнями. Кроме того, они должны находится в состоянии интенсивного роста (выход из фазы покоя и переход к активному росту). Луковицы, корневища и клубни в состоянии покоя непригодны, перед введением в культуру их предварительно обрабатывают высокими или низкими температурами. Способность к размножению также детерминирована генетически. Например, земляника размножается всеми способами, облепиха - ни одним, хотя в природе черенкуется. Двудольные обладают большей регенерационной способностью, чем однодольные и древесные.

При выборе экспланта необходимо учитывать его возраст, строение и происхождение. Для обеспечения максимальной стабильности клонируемого материала, во избежание появления аномальных растений в качестве экспланта желательно использовать молодые, слабодифференцированные ткани. Кроме того, экспланты от ювенильных растений лучше укореняются, чем от зрелых, особенно это касается древесных пород. Лучше всего использовать кончики стеблей, пазушные почки, зародыши, молодые листья, черенки, соцветия, чешую луковиц, то есть экспланты, содержащие меристемы. Опыты с эмбрионами кукурузы, проведенные Грином и Филипсом в 1975 году, показали, что при извлечении эмбрионов из зрелых семян они образуют каллус и корни. Если же изолировать их через 2 - 3 недели после опыления, то образуются и каллус, и растения. Вероятно, это связано с разворачиванием генетической программы в онтогенезе растения. Следует отметить, что не всегда молодые ткани являются удачным объектом для размножения. У эхеверии на эксплантах из молодых листьев возникают только корни, из старых - только побеги, из средних по возрасту - и побеги, и корни. Чем меньше размер экспланта, тем меньше его регенерационная способность. С другой стороны, в крупном экспланте увеличивается возможность появления в его клетках вирусов и других патогенов, что препятствует оздоровлению тканей.

Длительность культивирования также влияет на эффективность микроразмножения. Физиологическое состояние экспланта меняется в течение пассажей, при длительном культивировании частота укореняемости побегов возрастает. Возможно, что при этом эксплант приобретает признаки ювенильности, что ведет к повышению его морфогенетического потенциала.

Успех введения в культуру часто определяется эффективностью стерилизации. Выбор стерилизующего агента определяется особенностями экспланта. Для нежных тканей концентрация стерилизующего агента должна бать снижена, чтобы сохранить жизнеспособность экспланта. Часто внутреннее заражение исходных эксплантов бывает намного сильнее, чем поверхностное, поэтому экспланты предварительно обрабатывают фунгицидами и антибиотиками против грибной и бактериальной инфекций. Хорошие результаты дает обработка растений бензоатом натрия.

В зависимости от вида растений необходимо испытывать как твердые, так и жидкие питательные среды. Иногда жидкие среды имеют преимущество, так как обеспечивают большую подвижность трофических элементов. Например, при размножении роз более успешным было культивирование побегов на двухслойной питательной среде: нижний слой - агаризованный, верхний - жидкий. На эффективность размножения могут также влиять расположение экспланта (горизонтальное или вертикальное), тип пробок (ватные, пластмассовые, стеклянные, металлические и т.д.), а также соотношение объема эксплантов и количества питательной среды для оптимального освещения и газообмена эксплантов.

Состав питательной среды необходимо подбирать для каждого вида растений. На клональное микроразмножение влияют гормоны, минеральные соли, витамины и углеводы. При микроразмножении in vitro часто используют среды Мурасиге и Скуга, Линсмайера и Скуга, Шенка и Хильдебрандта, Нича, Гамборга, Хеллера и другие. Обычно используют среду Мурасиге-Скуга, которая содержит много неорганического азота, что стимулирует процессы органогенеза и соматического эмбриогенеза. В наших экспериментах (Кузьмина Н.А., Внукова В.В., 1997) выход морфогенных каллусов твердой пшеницы был выше на среде Мурасиге-Скуга по сравнению со средой Гамборга, которая одержала окисленные формы азота. Среда Мурасиге-Скуга также способствовала стабилизации хромосомного набора клеток твердой пшеницы при высоком содержании ауксина в среде. Вообще вопрос оптимального соотношения NH4 : NO3 остается открытым, так как литературные данные весьма противоречивы и универсального рецепта для всех видов растений нет. В качестве источника углеродного питания используют различные углеводы типа сахарозы, глюкозы, фруктозы, галактозы. Разные культуры требуют различной концентрации углеводов на разных этапах клонального микроразмножения.

К физическим факторам выращивания относятся температура и условия освещения. На первых двух этапах освещенность колеблется от 1000 до 3000 Лк, фотопериод 14 - 16 часов, но эти параметры зависят от культуры. Высокая интенсивность света может вызывать хлорозы и задерживать развитие, но при переносе в почву эти растения чувствуют себя лучше и растут энергичнее. Спектральный состав также играет немаловажную роль. Некоторые исследователи (Катаева Н.В., Аветисов В.А, 1981) указывают на синий свет как основной компонент морфогенеза. Красный свет стимулирует образование почек у табака, у салата - образование побегов, у березы - укоренение. В работах Т.Н. Константиновой с соавторами (1987) показано, что синий свет усиливает закладку вегетативных почек у побегов табака в условиях in vitro , а красный стимулирует развитие цветочных почек. Однако при добавлении цитокининов и ауксинов в различной концентрации соотношение процессов дифференциации цветочных и вегетативных почек меняется, в некоторых случаях наблюдается даже противоположный эффект. В исследованиях Р. А. Карначук и Е. С. Гвоздевой (1998) наибольший выход морфогенных каллусов пшеницы, формирующих растения и побеги, отмечен на зеленом свету. Важное значение играет также сочетание спектрального состава света и гормональных факторов среды.