Температура культивирования обычно варьирует в
интервале 22 - 26оС днем и 18 - 22оС ночью. В некоторых случаях понижение
температуры ведет к повышению эффективности размножения. Для повышения коэффициента
размножения необходимо каждому виду с учетом его естественного ареала
произрастания подбирать индивидуальные условия культивирования. Относительная
влажность воздуха - 65 - 70% [8]
. Адаптация растений к почвенным условиям
произрастания
Подготовка к высадке в поле (адаптация). Это очень важный этап, во время которого в теплице ускоренно растущие растения, полученные in vitro, адаптируют к новым условиям внешней среды: проводят их закаливание, повышают устойчивость к местным патогенным микроорганизмам и различным неблагоприятным факторам внешней среды.
Существует много различных способов адаптирования растений к пересадке in vitro. Сюда входит: подбор почвенного субстрата, создание определенной влажности, обработка химическими веществами (глицерин, парафин) для предотвращения обезвоживания листьев. Некоторые древесные растения лучше приживляются, если их заразить in vitro микоризообразующими грибами. Чтобы укоренившиеся побеги адаптировались к почвенным условиям, необходимо поддерживать определенную влажность («создание тумана»), температуры и т. д.
Упрощенный способ адаптации пробирочных растений винограда заключается в следующем:
Адаптация прямо в пробирках, снимая с них пробки, когда растения винограда достают до верха пробирки.
Через 1,5-2 недели, когда верхушки побега с двумя развитыми листьями появляются над пробиркой, растение готово к пересадке в почву.
Пересадка растений-регенерантов в субстрат является ответственным этапом, завершающим процесс клонального микроразмножения. Наиболее благоприятное время для пересадки пробирочных растений - весна или начало лета.
Растения с двумя-тремя листьями и хорошо развитой корневой системой осторожно вынимают из колб или пробирок пинцетом с длинными концами или специальным крючком. Корни отмывают от остатков агара и высаживают в почвенный субстрат, предварительно простерилизованный при 85-90° С в течение 1-2 ч. Для большинства растений в качестве субстратов используют торф, песок (3:1); торф, дерновую почву, перлит (1:1:1); торф, песок, перлит (1:1:1). Исключение составляют семейство орхидных, для которых готовят субстрат, состоящий из сфагнового мха, смеси торфа, листьев бука или дуба, сосновой коры (1:1:1).
Приготовленным заранее почвенным субстратом заполняют пикировочные ящики или торфяные горшочки, в которых выращивают растения-регенеранты. Горшочки с растениями помещают в теплицы с регулируемым температурным режимом (20-22° С), освещенностью не более 5 тыс. лк и влажностью 65-90%. Для лучшего роста растений создают условия искусственного тумана. В тех случаях, когда нет возможности создать такие условия, горшочки с растениями накрывают стеклянными банками или полиэтиленовыми пакетами, которые постепенно открывают до полной адаптации растений.
Через 20-30 дней после посадки хорошо укоренившиеся растения подкармливают растворами минеральных солей Кнудсона, Мурасига и Скуга, Чеснокова, Кнопа (в зависимости от вида растений) или комплексным минеральным удобрением. По мере роста растений их рассаживают в большие емкости со свежим субстратом. Дальнейшее выращивание акклиматизированных растений соответствует принятой агротехнике выращивания для каждого индивидуального вида растений.
Процесс адаптации пробирочных растений к почвенным условиям является наиболее дорогостоящей и трудоемкой операцией. Нередко после пересадки растений в почву наблюдается остановка в росте, опадение листьев и гибель растений. Эти явления связаны, в первую очередь, с тем, что у пробирочных растений нарушена деятельность устьичного аппарата, вследствие чего происходит потеря большого количества воды. Во-вторых, у некоторых растений в условиях in vitro не происходит образования корневых волосков, что приводит, в свою очередь, к нарушению поглощения воды и минеральных солей из почвы. Поэтому целесообразно на третьем или четвертом этапах клонального микроразмножения применять искусственную микоризацию растений (для микотрофных), учитывая их положительную роль в снабжении растений минеральными и органическими питательными веществами, водой, биологически активными веществами, а также в защите растений от патогенов.
Индийскими учеными предложен простой метод предотвращения быстрого обезвоживания листьев растений, выращенных in vitro, во время их пересадки в полевые условия. Метод заключается в том, что листья в течение всего акклиматизационного периода следует опрыскивать 50%-ным водным раствором глицерина или смесью парафина, или жира в диэтиловом эфире (1:1). Применение этого метода помогает избежать длинных и затруднительных процессов закаливания пробирочных растений и обеспечивает 100%-ную их приживаемость [8].
Для предотвращения механических повреждений корневой системы растение пересаживают в почву вместе с агаром, заглубляя его так, чтобы над поверхностью почвы оставались только развитые листы, которые выросли из пробирки и уже адаптировались к внешним условиям. Такая методика позволяет значительно упростить, ускорить и удешевить этапы роста, развития и акклиматизации растений.
Адаптация винограда. Упрощенный дешевый способ
адаптации растений винограда, выращенных в стерильных условиях в пробирках, был
разработан в Институте физиологии растений им. К. А. Тимирязева РАН. Адаптацию
проводят прямо в пробирках. Когда растения дорастают до пробки, его вынимают из
пробирки. Через 1,5-2 недели, когда верхушки побегов появляются над пробирками,
растения пересаживают в почву.
. Применение клонального микроразмножения для
выращивания декоративных растений
Основное преимущество клонального микроразмножения - получение генетически однородного, безвирусного посадочного материала. Предположение о возможности отсутствия вирусов в меристематических тканях больных растений впервые было высказано в 1936 г. Чунгом, а позднее, в 1943 г., и Уайтом. В 1949 г. этот факт был подтвержден экспериментально. В 1952 г. Морелю и Мартену из Национального агрономического института (Франция) удалось получить безвирусные георгины из зараженных растений.
Структурной основой используемого на практике явления служит специфика строения точки роста растений: дистальная ее часть, представленная апикальной меристемой, у разных растений имеет средний диаметр 200 мкм и высоту от 20 до 150 мкм. В нижних слоях дифференцирующиеся клетки меристемы образуют прокамбий, дающий начало пучкам проводящей системы.
Известно, что успех клонального микроразмножения зависит от меристематического экспланта. При этом отмечается закономерность: чем больше листовых зачатков и тканей, тем легче идут процессы морфогенеза, заканчивающиеся образованием целого растения. Вместе с тем, при таком развитии конуса нарастания увеличивается риск быстрой транспортировки вируса по проводящей системе. Кроме того, даже небольшой меристематический эксплант может содержать вирусы, проникшие в клетки в результате медленного распространения через плазмодесмы.
В целом, эффективность применения апикальной меристемы в качестве метода оздоровления зараженных вирусами растений может оказаться довольно низкой. Снизить риск попадания вирусов в здоровые ткани можно путем применения предварительной термо- или химиотерапии исходных растений.
Метод термотерапии применяется как в условиях in vivo, так и in vitro и предусматривает использование горячего сухого воздуха. Для объяснения механизма освобождения растений от вирусов в процессе термотерапии существуют различные гипотезы. Согласно одной их них при высоких температурах разрушаются белковая оболочка и нуклеиновая кислота вируса. Вторая гипотеза предполагает действие высоких температур на вирусы через метаболизм растений. При такой температуре начинает преобладать деградация вирусных частиц, а синтез их, наоборот, уменьшается. Растения, подвергающиеся термотерапии, помещают в термокамеры, где температура в течение первой недели повышается с 25 до 37оС путем ежедневного увеличения температуры на 2 градуса. Все остальные режимы обязательно поддерживаются в оптимальном состоянии: освещенность, высокая относительная влажность воздуха, определенный фотопериод. Продолжительность термостатирования зависит от состава вирусов и их термостойкости. Если для гвоздики достаточно 10 - 12 недельного воздействия теплом, то для хризантемы этот период превышает 12 недель.
Помимо положительного действия высоких температур на освобождение от вирусов, выявлено аналогичное влияние их на точку роста и процессы морфогенеза некоторых цветочных культур (гвоздики, фрезии) в условиях in vitro. Высокие температуры увеличивают коэффициент размножения на 50 - 60%, повышаю адаптацию пробирочных растений к почвенным условиям и позволяют получить больше безвирусных маточных растений.
Другой способ оздоровления - химиотерапия. В питательную среду, на которой культивируют апикальные меристемы, добавляют препарат вирозола в концентрации 20 - 50 мг/л. Это противовирусный препарат широкого спектра действия. Применение его позволяет увеличить число безвирусных растений с 40% до 80 - 100%.
Культура изолированных органов, тканей и клеток растений в настоящее время <http://chem21.info/info/1707373> находит все большее применение <http://chem21.info/info/1842458> в биологических исследованиях <http://chem21.info/info/860334>. Такие методы <http://chem21.info/info/1867145>, как клональное микроразмножение растений <http://chem21.info/info/1856528>, оздоровление от вирусной инфекции <http://chem21.info/info/265837> с помощью культуры апикальных <http://chem21.info/info/1414235> меристем, регенерация растений <http://chem21.info/info/587021> из каллусных культур <http://chem21.info/info/1856522>, находят сейчас практическое применение <http://chem21.info/info/133999>. Существенную помощь методы <http://chem21.info/info/392475> культивирования in vitro могут оказать генетикам и селекционерам в получении новых <http://chem21.info/info/260655> форм растений <http://chem21.info/info/98384>. Используя гаплоиды, незрелые или нежизнеспособные зародыши гибридов, сомаклональные варианты растений-регенерантов <http://chem21.info/info/1381330>, биотехиологи вместе с селекционерами ускоряют и облегчают селекционный процесс. Более сложная <http://chem21.info/info/1522460> техника манипулирования с клетками растений <http://chem21.info/info/98287> необходима для получения соматических гибридов <http://chem21.info/info/510695> слиянием протопластов <http://chem21.info/info/586706> или для генетической трансформации <http://chem21.info/info/1339190> клеток и растений.
Второе направление <http://chem21.info/info/1897140> - это использование культуры <http://chem21.info/info/587051> изолированных тканей для размножения и оздоровления посадочного материала <http://chem21.info/info/1896720>. Этот метод, названный клональным микроразмножением растений <http://chem21.info/info/1856528>, позволяет получать от одной меристемы сотни тысяч растений в год.
После оздоровления с помощью вышеперечисленных технологий нормальные растения-регенеранты <http://chem21.info/info/1381330> размножают обычными методами <http://chem21.info/info/1028404> клонального микроразмножения. Для некоторых растений <http://chem21.info/info/1685745>, например цитрусовых, получить морфогенез из меристем малого размера <http://chem21.info/info/332885> не удается, поэтому требуется разработка оригинальных методов. Лимоны и апельсины оздоровляют и размножают, используя прививки меристем размером 0,14-0,18 мм на пробирочные подвои, полученные из семян. Достоинство такого подхода состоит и в том, что развивающиеся из меристем побеги не имеют ювенильных признаков, при этом цветение и плодоношение ускоряются.
Помимо фундаментальных исследований <http://chem21.info/info/671199> метод культуры <http://chem21.info/info/200429> изолированных тканей широко <http://chem21.info/info/955278> используется в сельском хозяйстве <http://chem21.info/info/72275> и промышленном производстве <http://chem21.info/info/63171>. Примером может служить массовое клональное микроразмножение плодовоовощных и декоративных растений <http://chem21.info/info/924422>, а также их оздоровление от вирусных и других инфекций. С помощью культуры in vitro можно расширить возможности селекционной работы <http://chem21.info/info/1631380> получать клоны <http://chem21.info/info/1875726> клеток, а затем и растения с запрограммированными свойствами. Благодаря способности клеток синтезировать в культуре вторичные <http://chem21.info/info/1339356> метаболиты возникла отрасль промышленности <http://chem21.info/info/589680>, осуществляющая биологический синтез <http://chem21.info/info/1521355> веществ, необходимых человеку.
Некоторые из указанных технологий стали <http://chem21.info/info/1510038> традиционными, другие находятся на начальных этапах <http://chem21.info/info/972707> разработки. Наконец, есть такие методы <http://chem21.info/info/1867145>, которые явно вышли из ранга вспомогательных, ускоряющих селекцию технологий. К ним можно отнести криосохранение генофонда - технологию, в настоящий момент приобретшую экологическую направленность или клональное микроразмножение растений <http://chem21.info/info/1856528>, тесно связанное с проблемой их оздоровления от вирусных и других инфекций. Поэтому обзор этих технологий вынесен за рамки данного раздела.
Четвертый способ - размножение в биореакторах микроклубнями. Это один из способов ускоренного <http://chem21.info/info/1472297> размножения оздоровленного материала. О. Мелик-Саркисов сконструировал гидропонную установку, позволяющую получать около 7000 микроклубней с 1 м при массе одного кт ня 5 г. Предусмотрена последующая механизированная посадка их в грунт. В отделе биологии клетки <http://chem21.info/info/1277351> и биотехнологии Института физиологии растений <http://chem21.info/info/653057> им. К. А. Тимирязева РАН создана эффективная полупромышленная замкнутая система <http://chem21.info/info/4936> пневмоимпульсного биореактора для получения микроклубней картофеля, в которой предусмотрена возможность воздействия на направление и скорость процессов <http://chem21.info/info/9384> клубнеобразования <http://chem21.info/info/1349174>. Технологии клонального микроразмножения в биореакторах разработаны не только для сельскохозяйственных, но и для декоративных растений <http://chem21.info/info/924422> (лилии, гладиолусы, гиацинты, филодендроны и т.д.). Однако созданные установки <http://chem21.info/info/873645> пока носят лабораторный, модельный характер [7-8].
Технология клонального микроразмножение роз
Материалы и оборудование: 1-летние побеги роз, скальпель, кисточка, пинцет, стаканчик с этанолом, пробирки со стерильной водой, 4% раствор хлорамина,чашка Петри, кафельная плитка, спиртовка, спички, пробирки с модифицированной питательной средой МС, ее компоненты (макроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга (МС) <http://practice.biotechnolog.ru/recept1.htm>, микроэлементы по прописи МС, хелат железа, витамины по прописи МС, источник углерода: глюкоза - 40 г/л, агар-агар 7 г/л, гормоны: гиббереллин - 0.1 мг/л, 6-БАП - 2 мг/л, рН готовой среды 5.6-5.8).
В качестве экспланта используют боковые почки из средней части 1-летнего побега. Побеги промывают водопроводной водой с мылом, ополаскивают дистиллированной водой, вырезают почку. Стерилизуют сначала 70% этанолом в течение 1 минуты, а затем в растворе хлорамина 10 минут. Трижды промывают стерильной дистиллированной водой (в каждой порции по 10 минут). Срезы обновляют, снимают почечные чешуи и переносят почки на агаризованную питательную среду в пробирки. В некоторых случаях экспланты переносят на свежую питательную среду, так как в среду выделяются полифенолы. Культивируют при температуре 18-25оС, освещенности 500-1000 люкс, 16-часовом фотопериоде. Пассируется через 3-4 недели. Для укоренения побеги переносят на среду Гамборга (В5) <http://practice.biotechnolog.ru/recept1.htm> с добавлением 1 мг/л ИУК и увеличивают интенсивность освещения до 2000 люкс.