УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК
Государственный научный центр Российской Федерации -
Институт медико-биологических проблем РАН
А В Т О Р Е Ф Е Р А Т
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Морфофункциональное состояние и дифференцировочный потенциал культивируемых мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека при моделировании эффектов микрогравитации
14.00.32 - авиационная, космическая и морская медицина
03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология
Гершович Ю.Г.
Москва - 2009
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем РАН
Научный руководитель:
доктор медицинских наук, профессор Буравкова Людмила Борисовна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Гаврилюк Борис Карпович
доктор медицинских наук, профессор Оганов Виктор Сумбатович
Ведущая организация:
Учреждение Российской академии наук Институт биологии развития имени Н.К. Кольцова РАН
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Результаты, полученные в условиях космического полета и в модельных экспериментах, неоспоримо свидетельствуют о том, что костная система не может неизменно функционировать в условиях микрогравитации. Совокупность зарегистрированных физиологических изменений включает отрицательный баланс кальция, общую потерю массы костной ткани, деминерализацию в костях, несущих осевую опорную нагрузку на Земле, увеличение содержания в крови и моче маркеров костной резорбции [Ступаков, Воложин, 1989; Григорьев, Воложин, Ступаков, 1994; Газенко, Григорьев, Егоров, 1997; Оганов, 2003; Collet et al., 1997; Caillot-Augusseau et al., 1998; Vico et al., 2001]. Очевидно, что этот факт может существенно лимитировать продолжительность пребывания человека в космическом пространстве из-за потенциального риска развития остеопороза и сопровождаться негативными последствиями при возвращении в условия земной гравитации. Тем не менее, клеточные механизмы наблюдаемых изменений до настоящего времени остаются не до конца ясными.
Работы, выполненные в течение ряда последних лет, убедительно продемонстрировали, в том числе, и чувствительность культивируемых клеток остеобластического фенотипа к гравитационному фактору [Guignandon et al., 1995; Hughes-Fulford et al., 1996; Carmeliet et al., 1997; Kumei et al., 1998; Akiyama et al., 1999; Kacena et al.,2003; Hughes-Fulford et al., 2006; Kumei et al., 2006; Kumei et al., 2007]. Однако с увеличением количества экспериментальных данных перед исследователями встает новый вопрос: как может влиять микрогравитация или ее эффекты на различные аспекты функционирования менее зрелых клеточных форм, а именно на остеогенные клетки-предшественники и стволовые клетки.
В постнатальном развитии основным источником стволовых клеток является костный мозг [Фриденштейн и др., 1976, 1981]. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), локализованные в костном мозге и ряде других тканей и органов, способны к направленной дифференцировке в клеточные элементы костной, хрящевой и жировой тканей [Prockop, 1997; Jaiswal et al., 1997; Johnstone et al., 1998; Pittenger et al., 1999; Conget, Minguell, 1999; Muraglia et al., 2000; Janderova et al., 2003], а также клетки стромы, поддерживающей и регулирующей гемопоэз [Majumdar et al., 2003; McNiece et al., 2004; Maitra et al., 2004; Wagner et al., 2007]. Интерес к ММСК непрерывно растет, однако все большее число работ ставит новые вопросы в отношении вовлеченности ММСК в процессы самовозобновления и самоподдержания соединительных тканей и особенностей функционирования этих клеток in vitro и in vivo.
Определение роли гравитационного фактора в морфофункциональном состоянии клеток-предшественников представляется важной, но не простой задачей. Механизмы влияния микрогравитации на клетку могут быть определены только в дорогостоящих космических исследованиях, временные рамки и методологические возможности которых чаще всего ограничены. В наземных условиях эффекты воздействия микрогравитации на клетку моделируют с помощью различных экспериментальных систем [Albrecht-Buehler, 1992; Moore, Cogoli, 1996; van Loon, 2007]. Тем не менее, исследования, посвященные изучению гравитационной чувствительности ММСК in vitro, крайне немногочисленны, затрагивают какие-то отдельные характеристики клеток-предшественников, временные экспозиции клеток в данных системах не превышают нескольких суток культивирования, а результаты, полученные при использовании различных моделей, зачастую противоречивы [Zayzafoon et al., 2004; Meyers et al., 2004; Meyers et al., 2005; Buravkova et al., 2005; Yuge et al., 2006; Dai et al., 2007]. Таким образом, дальнейшее комплексное исследование морфофункционального состояния и дифференцировочного потенциала ММСК в условиях длительного моделирования эффектов микрогравитации позволит приблизиться к более глубокому пониманию процессов, происходящих в ходе физиологического и патологического ремоделирования костной ткани, а также пролить свет на проблему механочувствительности стволовых клеток взрослого организма.
Цель работы: Изучение морфофункционального статуса и дифференцировочного потенциала мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) костного мозга человека in vitro в условиях длительного моделирования эффектов микрогравитации с помощью различных экспериментальных установок.
В соответствии с данной целью были поставлены следующие
задачи исследования:
1) Подобрать оптимальные условия культивирования и индукции дифференцировки ММСК в условиях длительного моделирования эффектов микрогравитации, создаваемых с помощью горизонтального клиностата и Random Positioning Machine (Устройство для рандомизации положения, RPM);
2) Исследовать влияние моделирования эффектов микрогравитации на начальные стадии роста ММСК в норме и при их коммитировании к остеогенезу;
3) Провести иммунофенотипическую характеристику ММСК и остеогенных ММСК-производных после длительной экспозиции в условиях моделирования эффектов микрогравитации;
4) Изучить продукцию некоторых интерлейкинов в культурах ММСК и остеогенных ММСК-производных при моделировании эффектов микрогравитации;
5) Проанализировать эффективность начальных и конечных этапов индуцированной остеогенной дифференцировки ММСК и их остеогенных производных в условиях длительного моделирования эффектов микрогравитации;
6) Оценить эффективность индуцированной адипогенной дифференцировки ММСК и их адипогенных производных при длительном моделировании эффектов микрогравитации.
Научная новизна.
Впервые проанализировано влияние длительного (от 10 до 30-40 суток) моделирования эффектов микрогравитации с помощью двух различных наземных экспериментальных установок (горизонтальный клиностат и Random Positioning Machine - RPM) на основные характеристики ММСК костного мозга человека и производные от них коммитированные остеогенные клетки-предшественники, которые отражают морфофункциональное состояние культивируемых клеток. Получены новые данные, свидетельствующие о гравитационной чувствительности стволовых клеток взрослого организма и низкодифференцированных остеогенных клеток-предшественников. Впервые показано, что длительная экспозиция ММСК и остеогенных клеток-предшественников различного уровня коммитированности на горизонтальном клиностате или RPM подавляет клеточный прирост на начальных этапах воздействия, не влияя при этом на жизнеспособность клеток. Обнаружено, что длительное моделирование эффектов микрогравитации не оказывает влияния на экспрессию основных иммунофенотипических маркеров ММСК и производных от них остеогенных клеток (CD90, CD29, CD44), однако стимулирует выработку провоспалительного цитокина (ИЛ-8). Проведенные сравнительные исследования позволили установить, что в отличие от клиностатирования, которое оказывает незначительное влияние на завершающие этапы дифференцировки ММСК в остеогенном направлении, моделирование эффектов микрогравитации с помощью RPM подавляет как начальные (активация экспрессии мембранной формы щелочной фосфатазы, биосинтез коллагена I типа), так и терминальные этапы (формирование минерализованного матрикса) индуцированного остеогенеза остеогенных клеток-предшественников.
Впервые показано, что в данных экспериментальных условиях направленная адипогенная дифференцировка культивируемых ММСК и полученных из них коммитированных адипогенных клеток-предшественников не изменяется.
Полученные данные расширяют сложившиеся теоретические представления о восприимчивости стволовых клеток и коммитированных остеогенных клеток-предшественников к изменению параметров гравитационной среды в условиях in vitro.
Научно-практическая значимость работы.
Результаты, полученные в работе, могут служить основой для использования низкодифференцированных стромальных клеток костного мозга человека, а также производных от них коммитированных клеток-предшественников в качестве удобной экспериментальной модели для изучения процессов дифференцировки клеток-предшественников в условиях изменения параметров гравитационной среды, а также механизмов клеточной механочувствительности.
Подтверждена потенциальная возможность включения стволовых клеток и низкодифференцированных остеогенных клеток-предшественников в развитие локальных клеточных процессов адаптивной перестройки костной ткани, наблюдаемых в условиях гипокинезии и микрогравитации.
Проведенные сравнительные исследования позволяют рекомендовать использование коммерческой экспериментальной установки RPM как более адекватной модели для предупреждения процессов индуцированной остеогенной дифференцировки стволовых клеток по сравнению с клиностатом.
Результаты исследования могут быть использованы в материалах лекций по биологии стволовых клеток, авиационной, космической и морской медицине, а также учитываться при проведении биологических исследований.
Положения, выносимые на защиту:
I) Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга человека, как и производные от них остеогенные клетки-предшественники, восприимчивы к моделированию эффектов микрогравитации, что подтверждается подавлением процессов клеточного роста и остеогенной, но не адипогенной дифференцировки клеток различного уровня коммитированности, а также активацией продукции интерлейкина-8.
II) Для изучения морфофункционального состояния и процессов коммитирования стволовых клеток в условиях измененной гравитации способ моделирования эффектов микрогравитации с помощью RPM имеет преимущество перед горизонтальным клиностатированием, поскольку оказывает влияние не только на морфофункциональные характеристики ММСК, но более существенно воздействует на остеогенную дифференцировку клеток-предшественников.
Апробация работы. Основные результаты и положения диссертации доложены на VI и VII конференциях молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов, посвященных Дню космонавтики (Москва, 2007, 2008); XXII Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века». (Пущино, 2008). V Международном Симпозиуме «Актуальные проблемы биофизической медицины» (Киев, 2007); I школе-конференции «Методы культивирования клеток» (Санкт-Петербург, 2008), 28th Annual International Gravitational Physiology Meeting. (Сан-Антонио, США, 2007); 29th Annual International Gravitational Physiology Meeting (Анже, Франция, 2008).
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН “Космическая физиология и биология” 27.04.2009 г.
Связь работы с научными программами. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ №06-04-49781-а, гранта Президента Российской Федерации «Ведущие научные школы» НШ-3402.2008.4 и программы Фундаментальных исследований ГНЦ РФ - ИМБП РАН.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Текст диссертации изложен на 187 страницах, иллюстрирован 34 рисунками и 5 таблицами. Список литературы содержит 300 цитируемых источников, из которых 40 на русском и 260 на иностранном языке.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования являлись культуры мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека, любезно предоставленные д.б.н. Романовым Ю.А. (Научно-практическая лаборатория стволовых клеток человека НИИ РКНПК Росмедтехнологий). В экспериментах изучали влияние моделирование эффектов микрогравитации на ММСК 3-6 пассажей. Нормальные остеобласты человека были любезно предоставлены коллегами из Малайзии (Кен Университет).
Культивирование ММСК. В качестве среды для поддержания роста ММСК использовали среду DMEM-LG с содержанием глюкозы 1 г/л (Биолот, Россия), содержащую 2 мМ глутамина (MP Biomedicals, США), 1 мМ пирувата натрия, 12,5 мМ HEPES-буфера (Gibco или Sigma, США), 100 ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина (Биолот, Россия), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Hyclone-Defined, США). При достижении клетками 90% монослоя проводили пассирование клеток, рассаживали в соотношении 1:3. При этом использовали 20 мМ фосфатный буфер (MP Biomedicals, США) и раствор 0,25 % трипсин/0,05 % ЭДТА (Gibco или Sigma, США). Замену среды проводили каждые 3-4 дня. Культивирование в стандартных условиях проводили при 37оС в СО2-инкубаторе (Sanyo, Япония).