Моделирование эффектов микрогравитации, экспериментальные группы. Для моделирования эффектов микрогравитации использовали две экспериментальные установки: 1) клиностат, который осуществляет рандомизацию положения объекта относительно вектора земной гравитации за счет медленного вращения (6 об/мин) объекта с постоянной скоростью вокруг горизонтальной оси (СКБ 201-12 при ИМБП, Россия) и 2) Устройство для рандомизации положения - Random Positioning Machine (RPM, Dutch Space, The Netherlands). В процессе работы RPM происходит рандомизация положения объекта относительно вектора гравитации за счет разнонаправленного вращения двух взаимоперпендикулярных рамок, к которым крепится платформа с экспериментальными образцами. Само направление вектора гравитации при этом не меняется, однако имитируется эффект снижения влияния силы тяжести на культуру клеток [van Loon, 2007].
Во всех сериях экспериментов в качестве контролей использовали клетки, культивируемые в горизонтальном положении в статическом состоянии, а для анализа вклада постоянного перешивания среды культивирования при клиностатировании или при работе RPM - на горизонтальном шейкере при 60 оборотах в минуту.
Индукция и детекция остеогенной дифференцировки ММСК костного мозга человека. Направленную остеогенную дифференцировку ММСК осуществляли по общепринятому протоколу путем культивирования клеток в среде (DMEM-LG или DMEM-advanced; Gibco, США), содержащей 10-8 М дексаметазона (Sigma, США); 10 мМ бета-глицерол-2-фосфата и 0,2 мМ 2-фосфо-L-аскорбиновой кислоты (Fluka, Германия), [Jaiswal et al., 1997]. Для эксперимента клетки рассаживали во флаконы с плотностью 2500-5000 кл/см2. Через 24 часа прикрепившиеся клетки отмывали раствором Хенкса (Sigma, США), затем флаконы полностью заполняли соответствующей средой (средой роста или остеогенной), не оставляя пузырьков воздуха, после чего дополнительно герметизировали эластичной пленкой «Парафильм», закрывали крышками и переносили на клиностат или RPM. Период культивирования составлял 10-40 суток.
Эффективность остеогенеза в условиях моделирования эффектов микрогравитации оценивали на ранних и поздних этапах остеогенной дифференцировки клеток. Ранние этапы остеогенной дифференцировки клеток оценивали путем гистохимического выявления активности щелочной фосфатазы при помощи коммерческого набора «Alkaline phosphatase kit» (Sigma 86C-1kit, США) согласно инструкции производителя. Кроме того, количественная оценка процентного содержания клеток, вступивших на путь остеогенной дифференцировки, проводилась с помощью метода проточной цитофлюориметрии (проточный цитофлюориметр, Epics XL, Beckman Coulter, США) с использованием антител к щелочной фосфатазы, меченных PE (R&D, США). Активацию биосинтеза коллагена I типа в культурах остеогенных производных ММСК выявляли с помощью иммунофлюоресцентного микроскопического анализа, используя моноклональные антитела против коллагена I типа (Sigma, США). Поздние стадии остеогенеза клеток оценивали по накоплению минерализованных компонентов матрикса. Идентификацию кальциевых депозитов осуществляли путем гистохимического выявления солей кальция в культурах 40 мМ Ализариновым красным S (Alizarin red S, Sigma, США), рН 4,2 c добавлением 2,8% гидроксида аммония [Пирс, 1962].
Для оценки чувствительности остеогенных клеток-предшественников различного уровня коммитированности к моделированию эффектов микрогравитации использовали остеогенные производные ММСК, полученные путем предварительной остеогенной стимуляции. Для этого ММСК культивировали в течение 7 суток в остеогенной среде в стандартных условиях CO2-инкубатора. По прошествии 7 суток клетки пересаживали 1:1, после чего еще 3 дня поддерживали в остеогенной среде в CO2-инкубаторе, а затем культуры переносили на клиностат или RPM в соответствии с описанной выше процедурой.
Гистохимические реакции оценивали с помощью микроскопа Leica DMIL, оборудованного цифровой видеокамерой, иммунофлюоресцентное окрашивание анализировали на микроскопе Axiovert 25 (Zeiss, Германия), оснащенном цифровой видеокамерой AxioCam HRm (Zeiss, Германия).
Исследование прироста количества клеток в культурах ММСК костного мозга человека, а также в процессе коммитирования клеток к остеогенной дифференцировки проводили с помощью компьютеризированной видео-микроскопии, подсчитывая число клеток через 24, 48 и 72 часа в случайно выбранных фиксированных полях зрения фазово-контрастного микроскопа (Axiovert 25, Zeiss, Германия), оборудованного цифровой видеокамерой (AxioCam HRm, Zeiss, Германия), при помощи программы анализа изображений Sigma Scan Pro 5 (Sigma, США). В каждом флаконе с культурами просчитывали не менее восьми стационарных полей зрения, флаконы в экспериментальных группах были продублированы.
Жизнеспособность клеток оценивали по количеству апоптотических и некротических клеток методом проточной цитофлуориметрии с помощью набора ANNEXIN V-FITC Kit (Immunotech, Франция) согласно инструкции производителя. Апоптотические клетки определялись за счет высокоаффинного связывания аннексина V, меченого FITC. Некротические клетки определялись за счет происходящего при повреждении целостности клеточных мембран связывания пропидия йодида с ДНК. Иммунофенотипическую характеристику клеток проводили с помощью моноклональных антител (Beckman Coulter, Франция или Biolegend, США), меченых FITC (CD34, CD90, CD44, HLA A,B,C) и PE (CD45, CD29, CD106, HLA DR), методом проточной цитофлюориметрии (Epics XL, Beckman Coulter, США). В качестве контроля использовали пробы с добавлением неиммунных меченых FITC и PE моноклональных антител того же изотипа, что и антитела против исследуемого маркера.
Исследование количественного содержания цитокинов в кондиционированной среде культивирования проводили с помощью метода твердофазного иммуноферментного анализ, используя коммерческие наборы "Human IL-7", "Human IL-8/NAP-1", "Human TNF-б" согласно инструкции производителя (BioSourse International Inc., Бельгия). Пробы кондиционированной среды культивирования ММСК и остеогенных производных ММСК отбирали каждые 10 суток.
Индукция и детекция адипогенной дифференцировки. Направленную адипогенную дифференцировку ММСК осуществляли путем культивирования клеток в среде роста DMEM-LG, либо обогащенной среде DMEM/F12 (Sigma, США), содержащей 10-6 М дексаметазона (Sigma, США), 200 µM индометацина, 0,5 мМ изобутил-метил-ксантина (Fluka, Германия) и 10 µM инсулина (Sigma, США) согласно общепринятому протоколу [Janderova et al., 2003]. Также изучали дифференцировочный потенциал полученных из ММСК престимулированных адипогенных производных. Для этого ММСК инкубировали в среде с адипогенными стимулами в течение 10 суток в стандартных условиях CO2-инкубатора, после чего коммитированные адипогенные культуры экспонировали на RPM еще 10 суток.
Эффективность адипогенеза оценивали по изменению морфологии клеток и накоплению в цитоплазме клеток липидных капель, которые визуализировали путем окрашивания с помощью 0,36% масляного красного (Oil Red O, Sigma, США). Подсчет количества окрашенных адипоцитов осуществляли в 10 случайно выбранных полях зрения микроскопа Leica DMIL, при 10-кратном увеличении объектива, используя программу анализа изображений Sigma Scan Pro 5 (Sigma, США).
Статистическая обработка результатов. В качестве характеристик полученных выборок использовали среднее, стандартное отклонение, стандартную ошибку среднего, объем выборки. Статистическую обработку результатов проводили с использованием методов вариационной статистики программы “Excel” для WinXP. Статистическую достоверность различий между двумя группами данных оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни (для малых и средних выборок, n<30) или критерия Стьюдента (для больших выборок, n?30). Межгрупповые отличия считали достоверными при p<0,05.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Характеристика культивируемых мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека.
Исследуемые клетки костного мозга человека представляли собой морфологически гомогенную популяцию адгезивных фибробластоподобных клеток, в которой были представлены клетки преимущественно веретеновидной или тригональной формы, равномерно покрывающие поверхность культурального пластика в процессе роста культуры (Рис.1). При посеве с низкой плотностью (50 кл/см2) клетки образовывали дискетные клональные колонии (Рис.2). При посеве с обычной плотностью (4000-5000 кл/см2) ранние пассажи ММСК, полученные от различных доноров, обладали похожей пролиферативной активностью, достигая стадии конфлюэнтного монослоя в среднем за 7-10 суток.
Изучаемые клетки костного мозга человека экспрессировали целый ряд поверхностных мембранных антигенов (кластеров дифференцировки или CD), которые регулируют различные аспекты функционирования клеток-предшественников (адгезия, миграция, рецепция и ко-рецепция, рециркуляция), и в целом формируют характерный для ММСК иммунофенотипический профиль. В частности, у всех клеток, используемых в экспериментах, были выявлены поверхностные антигены, которые в настоящее время широко используются как позитивные критерии для идентификации ММСК [Тепляшин и др., 2005; Паюшина и др., 2006; Суздальцева и др., 2007; Pittenger et al., 1999; Conget, Minguell, 1999; Zuk et al., 2001; Majumdar et al., 2003; Wagner et al., 2005; Dominici et al., 2006], а именно: CD90 (Thy-1), CD105 (Endoglin, рецептор TGF-в), CD44 (HCAM, рецептор гиалуроновой кислоты), CD29 (в1-интегрин, ко-рецептор VCAM-1, фибронектина, коллагена, ламинина), CD106 (VCAM-1, молекула адгезии васкулярных клеток), CD54 (ICAM-1, молекула межклеточной адгезии, ко-рецептор в2-интегрина), HLA A,B,C, (MHC I класс), при этом клетки не экспрессировали маркеры гемопоэтических клеток, такие как HLA DR, CD34 и CD45 (Рис.3).
Рис. 1. Культура ММСК костного мозга человека 6 пассажа, фазовый контраст, Ув.х100.
Рис. 3. Иммунофенотип ММСК костного мозга человека 7 пассажа. По оси абцисс - FITC, по оси ординат - PE, для каждого CD-кластера было проанализировано 10 тыс. клеток.
Рис. 4. Дифференцировочные потенции ММСК костного мозга человека 3 пассажа.
а - накопление и слияние липидных капель в ходе адиподифференцировки ММСК, Ув.х200; б - индуцированная активность щелочной фосфатазы в ходе остеодифференцировки ММСК, Ув.х100; в - единичные клетки, эндогенно экспрессирующие ЩФ, в культуре ММСК указаны стрелками; Ув.х100; г - эндогенная активность ЩФ в культуре остеобластов человека 9 пассажа, Ув.х100; д - отсутствие экспрессии ЩФ в культуре ММСК; е - экспрессия ЩФ в культуре остеобластов человека. (Кривая С указывает на процентное содержание позитивно окрашенных клеток в популяции).
При оценке дифференцировочного потенциала ММСК костного мозга человека была подтверждена их способность дифференцироваться в клетки мезенхимного происхождения (Рис.4, а,б), по крайней мере, по двум основным направлениям коммитирования (остеогенное, адипогенное) в ответ на присутствие соответствующих стимулов в среде культивирования [Jaiswal et al., 1997; Conget, Minguell, 1999; Pittenger et al., 1999; Janderova et al., 2003; Sekiya et al., 2004].
ММСК костного мозга человека не дифференцировались спонтанно в адипогенном направлении даже при длительном (20 суток) культивировании в среде роста. В ходе индуцированного адипогенеза клетки теряли способность к делению, приобретали сферическую или близкую к ней форму, группировались в пределах отдельных колоний или кластеров клеток, накапливающих в цитоплазме липидные включения различного размера, что соответствует фенотипу дифференцирующихся адипобластов [Janderova et al., 2003]. На поздних этапах дифференцировки мелкие липидные капли сливались в одну большую жировую каплю, заполняющую весь объем клетки (Рис.4, а). Для ММСК костного мозга человека не была характерна спонтанная инициация остеогенеза даже при длительном росте в культуре, что свидетельствует о высокой селективности метода выделения ММСК человека и чистоте популяции стволовых клеток от коммитированных остеогенных предшественников, экспрессирующих щелочную фосфатазу (ЩФ), и, как известно, обильно представленных в костном мозге. В неиндуцированном состоянии в исследуемых культурах ММСК эндогенная активность ЩФ выявлялась лишь в единичных случаях, а доля клеток, экспрессирующих мембранную форму ЩФ, не превышала 0,5-1% от всей популяции. В то же время, к примеру, у линии нормальных остеобластов человека эндогенная активность ЩФ и экспрессия мембранной формы белка была характерна для подавляющего большинства клеток (87%) в популяции (Рис.4, в,е). Под влиянием остеогенных стимулов количество клеток, в которых определялась индуцированная активность ЩФ, прогрессивно увеличивалось, при этом культуры теряли свойство останавливать дальнейший рост при достижении стадии конфлюэнтного монослоя, а ЩФ+- клетки формировали многослойные «узелки». В ходе остеогенной дифференцировки ММСК были способны проходить весь цикл от ранних остеогенных предшественников (ЩФ+) до зрелых форм, откладывающих соли кальция во внеклеточную среду и минерализующих органический матрикс, что соответствует известным представлениям об основных характеристиках остеогенеза ММСК in vitro.
Образом, используемые клеточные культуры костного мозга человека характеризовались комплексом морфофункциональных параметров, отражающих их фенотипическую принадлежность, в частности, обладали свойственными ММСК морфологическими особенностями и высоким потенциалом к экспансии, сохраняющимся на протяжении ряда этапов субкультивирования; экспрессировали характерные поверхностные антигены и, наконец, были способны реализовать заложенные в них дифференцировочные потенции, что в совокупности свидетельствовало о сохранении и поддержании высокого уровня функциональной активности in vitro исследуемыми клетками.
Влияние клиностатирования на морфофункциональное состояние ММСК и остеогенных производных ММСК костного мозга человека.
Увеличение количества клеток в растущей клеточной линии можно рассматривать как один из информативных показателей поведения культуры, который отражает ее функциональное состояние. В результате проведенных нами исследований было установлено, что на начальных этапах экспозиции клеток на клиностате наблюдается статистически достоверное уменьшение прироста клеток, культивировавшихся как в обычной среде роста (собственно ММСК), так и в среде с добавлением остеогенных дифференцировочных стимулов (остегенные производные ММСК) (Рис.5, а,б). Было показано, что после 72 часов экспозиции клеток в условиях клиностатирования их прирост уменьшается в 4-6 раз по сравнению с группами статического контроля и шейкера.
мультипотентный мезенхимальный остеогенез коллагеновый
Рис.5. Динамика роста клеток-предшественников 5 пассажа при клиностатировании. (Представлен средний прирост числа клеток в поле зрения и стандартное отклонение среднего n=18; p<0,01* - различия достоверны начиная с 24 часов воздействия, критерий Манна-Уитни). СК - статический контроль, КЛ - клиностат, Ост - значения получены при культивировании клеток в остеогенной среде.
Оценка жизнеспособности ММСК и клеток, коммитированных к остеогенной дифференцировке показала, что в условиях клиностатирования доля апоптотических и некротических клеток в популяции не увеличивается (Табл.1), что свидетельствует о том, что, несмотря на подавление роста клеток, моделирование эффектов микрогравитации с помощью клиностата не оказывает существенного влияния на их жизнеспособность.
В настоящее время высказывается мнение, что наблюдаемые реакции подавления роста остеогенных клеток в условиях микрогравитации связаны не с физической потерей числа рецепторов на мембране, которые при связывании с различными факторами роста обеспечивают переход клеток в фазу пролиферации, а скорее изменениями в системе трансдукции сигналов [Akiyama et al., 1999; Boonstra, 1999; Hughes-Fulford, 2001]. В частности эти эффекты могут быть обусловлены ингибированием сигнальных путей на уровне активности MAP-киназ (митоген-активируемых протеинкиназ), которые наряду с другими факторами вовлечены в регуляцию процессов пролиферации и остеогенной дифференцировки ММСК, тем более, что уменьшение уровня фосфорилирования ERK1/2MAPК в условиях гипогравитации и гипокинезии у коммитированных к остеогенезу ММСК было показано в некоторых работах [Zayzafoon et al., 2004; Dai et al., 2007; Pan et al., 2008]. Неспособность клеток нормально реагировать на митогенные сигналы в условиях микрогравитации в космическом полете была показана при исследовании остеобластоподобных клеток мыши линии MC3T3-E1 и нормальных остеобластов, выделенных из свода черепа цыпленка [Hughes-Fulford et al., 1996; Kacena et al., 2003]. Интересно, что ММСК человека, культивируемые в обычной среде, демонстрировали увеличение пролиферативной активности при кратковременной экспозиции на 3D-клиностате [Yuge et al., 2006].