Автореферат: Морфофункциональное состояние и дифференцировочный потенциал культивируемых мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека при моделировании эффектов микрогравитации

Табл. 1. Жизнеспособность ММСК и их остеогенных производных после 48 часов экспозиции на клиностате. (Представлен средний % апоптотических (AnnV+) и некротических (PI+) клеток, а также стандартное отклонение среднего. Суммарные данные четырех независимых экспериментов, в каждом из которых анализировали 5-10 тыс. клеток). СК - статический контроль, Ш - шейкер, КЛ - клиностат, Ост - значения получены при культивировании клеток в остеогенной среде.

При исследовании влияния 20-суточного клиностатирования на экспрессию некоторых поверхностных маркеров ММСК и клеток, коммитированных к остеогенной дифференцировке одновременно с началом экспозиции на клиностате, было обнаружено, что у клеток сохраняется экспрессия основных поверхностных антигенов стромальных клеток, таких как CD90, CD29 и CD44 и HLA I класса. (Табл.2), однако при остеогенном коммитировании клеток немного уменьшалась доля клеток, экспрессирующих HLA I класса. Изучение процентного содержания клеток, экспрессирующих CD106, показало, что уровень позитивно окрашиваемых клеток сильно варьирует на разных этапах культивирования ММСК, что согласуется с данными, полученными другими авторами [Анохина, Буравкова, 2007]. При этом было выявлено, что в культурах остеогенных производных ММСК, культивируемых в остеогенной среде в течение 20 суток, частично или полностью исчезает субпопуляция клеток, экспрессирующих CD106, что соответствует данным литературы [Liu et al., 2008].

Утрата экспрессии CD106 определенной долей клеток в популяции при остеогенном коммитировании ММСК может свидетельствовать о потере клетками свойства мультипотентности, так как в некоторых работах CD106 рассматривается в качестве специфического маркера именно стволовых клеток [Kolf et al., 2007]. Известно, что фибробласты кожи, используемые в ряде исследований в качестве примера терминально-дифференцированных клеток - производных мезенхимы, не обладают экспрессией CD106 и не мультипотентны [Суздальцева и др., 2007]. Кроме того, экспрессия CD106 не определяется на мезенхимных клетках-предшественниках, выделяемых из жировой ткани [Тепляшин и др., 2005; Zuk et al., 2002], что может указывать на их принадлежность к популяции коммитированных клеток-предшественников.

Таблица. 2. Иммунофенотип ММСК и остеогенных производных при клиностатировании.

Для каждого CD-кластера было проанализировано 2-5 тыс. клеток. СК - статический контроль, Ш - шейкер, КЛ - клиностат, Ост - значения получены после 20-суточного культивирования клеток в остеогенной среде.

Гуморальные факторы, формирующие систему межклеточного взаимодействия, включают разнообразные метаболиты клеток. Цитокины являются наиболее универсальным классом внутри- и межтканевых «коммуникаторов» широкого спектра действия [Пальцев, Иванов, 1995]. Однако вопрос о вовлеченности ММСК и остеогенных клеток-предшественников в систему аутокринной и паракринной регуляции в условиях измененной гравитации остается открытым.

При анализе продукции интерлейкинов ММСК и остеогенными производными стромальных клеток было показано, что длительная (10 и 20 сут) экспозиция клеток на клиностате не приводит к активации продукции ИЛ-7 и TNF-б, которые в культурах контрольных и опытных клеток не выявляются. Исследования показали, что 10-суточная экспозиция клеток на клиностате не приводит к значимым изменениям продукции ИЛ-8 в среду культивирования как ММСК, так и клеток, которые росли в среде, содержащей остеогенные стимулы. Продукция ИЛ-8 в культуре ММСК за 10 суток культивирования в среднем составляла 22,0±11,6 pg/ml в группе статического контроля, 23,3±14,4 pg/ml в группе клеток, экспонированных на шейкере, и 24,5±10,6 pg/ml в культуре клиностатируемых клеток. Однако более длительное клиностатирование приводило к значительной активации продукции ИЛ-8 в среду культивирования клеток. В стандартной среде роста продукция ИЛ-8 при клиностатировании в течение 20 суток возрастала в 1,4-2 раза для ММСК различных пассажей; в остеогенной - в 2,7-3,2 раза (Рис.6).

Таким образом, на поздних этапах экспозиции клеток в условиях клиностатирования происходит активация секреции провоспалительного нейтрофил-активирующего фактора - интерлейкина-8, вырабатываемого ММСК и их остеогенными производными. Этот факт, по-видимому, указывает на возможность протекания отсроченных стрессорных реакций как в популяциях низкодифференцированных, так и в более зрелых культурах остеогенных клеток-предшественников и может отражать ответную реакцию клеток мезенхимного происхождения на изменение физических параметров среды обитания.

Рис. 6. Продукция ИЛ-8 при клиностатировании в течение 20 суток. (а) - ММСК, (б) - остеогенные производные ММСК. (M±SD), СК - статический контроль, Ш - шейкер, КЛ - клиностат.

Влияние клиностатирования на дифференцировочный потенциал ММСК и коммитированных клеток-предшественников.

По общему мнению, щелочная фосфатаза является наиболее ранним и характерным маркером остеобластического коммитирования клеток. При оценке влияния клиностатирования на начальные этапы остеогенной дифференцировки ММСК было показано, что в ходе приобретения клетками остеобластического фенотипа в условиях моделирования эффектов микрогравитации в течение 10-20 суток число клеток, экспрессирующих на своей поверхности ЩФ, существенно не отличается от наблюдаемого в группе клеток, культивируемых в статических условиях. Тем не менее, исследования показали, что в группе клеток, вступивших на путь дифференцировки при культивировании на шейкере, количество ЩФ⁺- клеток в среднем на 10% выше чем в других экспериментальных группах, что свидетельствует о стимулирующем влиянии перемешивания среды культивирования на начальные этапы дифференцировки ММСК в остеобласты (Рис.7, а,б).

В противовес полученным нами данным, при изучении влияния 3D-клиностатирования на остеогенную дифференцировку нормальных остеобластов человека было обнаружено, что определенные показатели дифференцировки клеток, такие как активность ЩФ, образование костных узелков, а также минерализация матрикса, значительно редуцируются [Yuge et al., 2003]. Аналогичное ингибирование активности ЩФ наблюдалось и при кратковременной экспозиции остеобластов мыши линии 2T3 на RPM [Pardo et al., 2005]. Высказывается предположение, что подавление начальных этапов остеогенной дифференцировки клеток-предшественников в условиях моделирования эффектов микрогравитации обусловлено изменениями в уровне активности киназы p38^МАРК [Yuge et al., 2003] или киназы ERK Ѕ ^МАРК [Zayzafoon et al., 2004].

Рис. 7. Индуцированная экспрессия мембранной формы щелочной фосфатазы. (а) - экспозиция 10 суток, (б) - экспозиция 20 суток. (M±m, суммарные данные четырех независимых экспериментов, в каждом из которых анализировали 5-10 тыс клеток). СК - статический контроль, Ш - шейкер, Кл - клиностат.

А

Б

С

Рис.8. Организация внеклеточного коллагенового матрикса в культурах ММСК (А), экспозиция 10 суток и остеогенных производных ММСК, экспозиция 10 и 20 суток (Б, С). Иммуно-флюоресцентное окрашивание антителами к коллагену I типа, вторичные антитела PE.

Следующий этап нашего исследования был посвящен оценке «качества» органических и неорганических компонентов внеклеточного матрикса. Небольшое количество коллагена I типа в цитоплазме клеток выявлялось и в культурах нестимулированных ММСК (Рис.8, А). Под влиянием остеогенных стимулов в культуре клеток значительно возрастала внеклеточная продукция коллагена, с формированием трехмерной разветвленной сети органического матрикса. Как показано на Рис. 8, в контрольных группах клеток внеклеточный матрикс был достаточно хорошо структурирован. Островки коллагенового матрикса были мельче и аморфнее в опытной группе клеток после 10 суток экспозиции на клиностате. Интересно, что к 20-м суткам экспозиции описанные различия практически исчезали. Таким образом, клиностатирование, вероятно, оказывало ингибирующее влияние, по крайней мере, на определенные этапы индуцированной остеогенной дифференцировки ММСК в ходе коммитирования клеток к остеогенезу в условиях моделирования эффектов микрогравитации, что выражалось в ухудшении биосинтеза коллагена I типа и сопутствующем уменьшении зон, занимаемых внеклеточным матриксом.

А

Б

Рис.9. Влияние клиностатирования на минерализацию внеклеточного матрикса.

А - кальциевая минерализация матрикса, образованная в ходе остеогенеза ММСК, Ув.х100; Б - кальциевая минерализация матрикса, образованная в ходе остеогенеза престимулированных остеогенных производных ММСК, Ув.х200.

Экспозиция 30 суток (а, в - статический контроль; б, г - клиностат).

Рис.10. Влияние клиностатирования на эффективность адипогенеза ММСК. (Усредненные данные трех независимых экспериментов, представлено среднее значение числа клеток в поле зрения и стандартное отклонение среднего, n=30; p<0,01*# - разли чия достоверны по сравнению со статическим контролем и клиностатом, критерий Стьюдента). СК - статический контроль, Ш - шейкер, КЛ - клиностат.

На 30-40 сутки постоянного культивирования клеток в среде, содержащей остеогенные стимулы, в культурах остеогенных производных ММСК выявлялись очаги аморфного фосфатно-кальциевого вещества. В дальнейшем очаги кальциевой минерализации сливались друг с другом, превращая образованный коллагеном остеоид в обезыствленный костный матрикс, в результате чего культуры остеогенных производных ММСК оказывались «замурованы» в минерализованное межклеточное вещество. При оценке интенсивности кальцификации матрикса в растущих остеогенных культурах ММСК, последовательно прошедших все этапы остеогенеза в условиях клиностатирования, вопреки ожиданиям, не было выявлено значимых отличий в уровне кальциевой минерализации матрикса по сравнению с контролем, а сама интенсивность минерализации была достаточно низкой во всех экспериментальных группах (Рис. 9, А). Однако в случае экспозиции на клиностате престимулированных остеогенных производных ММСК, на аналогичных временных сроках экспозиции, процесс кальцификации в клиностатируемых культурах, хотя и не полностью, но подавлялся, что свидетельствует о замедлении терминальных этапов дифференцировки остеогенных клеток-предшественников в остеобласты в условиях клиностатирования (Рис. 9, Б).

При анализе адипогенного дифференцировочного потенциала ММСК костного мозга человека было отмечено, что эффективность адипогенеза после 20 суток воздействия адипогенных стимулов была сходной как в клиностатируемых, так и в контрольных культурах адипогенных производных (Рис. 10). При этом количество формирующихся адипоцитоподобных клеток было примерно равным в группах статического контроля и клиностата и немного сниженным при культивировании клеток на шейкере, что хорошо согласуется с фактом увеличения эффективности коммитирования клеток в остеогенном направлении в этом случае. Таким образом, моделирование эффектов микрогравитаци с помощью клиностатирования не оказывало заметного влияния на адипогенную дифференцировку ММСК костного мозга человека.

Морфофункциональное состояние ММСК и остеогенных производных ММСК в условиях моделирования эффектов микрогравитации с помощью RPM.

Динамику роста клеток костного мозга человека в условиях моделирования эффектов микрогравитации с помощью RPM, как и при клиностатировании оценивали в течение первых трех суток экспозиции. Было показано, что при моделировании эффектов микрогравитации также наблюдается статистически достоверное уменьшение клеточного прироста, как собственно ММСК, так и при коммитировании ММСК к остеогенезу (p<0,01, критерий Манна-Уитни, Рис 11). Уменьшение прироста клеток относительно контрольных групп составило 1,6-2 раза. Такое же угнетение клеточного прироста наблюдалось и в культурах нормальных остеобластов человека, культивируемых в обычных условиях и в среде, содержащей остеогенные стимулы.