Автореферат: Морфофункциональное состояние и дифференцировочный потенциал культивируемых мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека при моделировании эффектов микрогравитации

Рис. 11. Динамика роста клеток при моделировании эффектов микрогравитации с помощью RPM. (Данные репрезентативного эксперимента с клетками 3 пассажа, представлен средний прирост числа клеток в поле зрения и стандартное отклонение среднего, n=16; p<0,01^* - различия достоверны по критерию Манна-Уитни). СК - статический контроль, Ш - шейкер, Ост - значения получены при культивировании клеток в остеогенной среде.

При проведении иммунофенотипической характеристики ММСК костного мозга человека и клеток, коммитированных к остеогенной дифференцировке в условиях моделирования эффектов микрогравитации с помощью RPM, было показано, что доля клеток, экспрессирующих основные поверхностные антигены стромальных клеток - CD90, CD29 и CD44 остается постоянной, а экспрессия гемопоэтических маркеров CD45 и HLA DR не активируется (Табл.3). Было обнаружено, что экспозиция клеток на RPM не влияет на процентное содержание клеток, экспрессирующих CD106, однако при коммитировании ММСК к остеогенезу в условиях измененной гравитации доля клеток, экспрессирующих HLA I класса была на 10-20% выше по сравнению со значениями в контрольных группах клеток, что, вероятно, можно рассматривать как сохранение менее дифференцированного состояния культуры.

Несмотря на отсутствие выраженных модификаций иммунофенотипа изучаемых клеток при длительном моделировании эффектов микрогравитации, существуют данные, указывающие на возможность таких изменений при кратковременных экспозициях. Так, в одной из работ было продемонстрировано, что 7-суточная экспозиция ММСК человека на 3D-клиностате приводит к увеличению доли клеток в популяции, экспрессирующих CD90/CD29 и CD90/CD44 [Yuge et al., 2006]. Интересно, что 5-суточное пребывание нормальных остеобластов крысы в условиях микрогравитации приводило к увеличению уровня мРНК CD44, при этом экспрессия в1-интегрина (CD29) в клетках не изменялась [Kumei et al., 2006].

Таблица. 3. Иммунофенотип ММСК и остеогенных производных при моделировании эффектов микрогравитации с помощью RPM в течение 20 суток.

Для каждого CD-кластера было проанализировано 2-5 тыс. клеток. СК - статический контроль,Ш - шейкер, КЛ - клиностат, Ост - значения получены после 20-суточного культивирования клеток в остеогенной среде.

Изучение уровня выработки ИЛ-8 в культурах ММСК и остеогенных производных ММСК различного уровня коммитированности показало, что экспозиция клеток на RPM в отличие от клиностатирования приводит к более ранней активации его продукции, однако эта активация была выражена в разной степени у ММСК различных пассажей. Так, культуры ММСК 3 пассажа экспонированные на RPM в течение 10 суток, вырабатывали 184,3±44,3 pg/ml ИЛ-8, против 25,1±6,1 pg/ml в группе статического контроля, а клетки 6 пассажа в опытной группе - 36,2±0,6 pg/ml против 16,4±0,2 pg/ml ИЛ-8. Кроме того, престимулированные остеогенные производные ММСК характеризовались более высоким уровнем продукции ИЛ-8, в опытной группе продукция ИЛ-8 составляла 1101±21,0 pg/ml, а в контрольной 632,5±5,5 pg/ml.

Известно, что продукция ИЛ-8 у ММСК возрастает в результате реакции на циклическое механическое растяжение, при этом клетки, культивируемые в остеогенной среде, показывают максимально выраженное повышение продукции ИЛ-8, что свидетельствует о важной роли данного цитокина в механизмах клеточной механочувствительности [Sumanasinghe et al., 2008]. Интересно, что многократная активация продукции ИЛ-8 была выявлена у эндотелиальных клеток при моделировании эффектов микрогравитации c помощью RPM [Ulbrich et al., 2008], что указывает на потенциальное участие данного цитокина в паракринных реакциях различных типов клеток в этих условиях.

Дифференцировочный потенциал ММСК и коммитированных клеток-предшественников при моделировании эффектов микрогравитации с помощью RPM.

При исследовании уровня экспрессии ЩФ при коммитировании ММСК к остеогенезу в условиях моделирования эффектов микрогравитации с помощью RPM в течение 10-20 суток было выявлено достоверное уменьшение процентного содержания клеток на поверхности которых обнаруживается ЩФ (Рис.12). Максимальная доля ЩФ⁺-клеток в популяции выявлялась в остеогенных культурах, которые росли и дифференцировались в условиях перемешивания среды культивирования с помощью шейкера, группа статического контроля занимала промежуточное положение, и наконец, минимальное количество ЩФ⁺-клеток было выявлено при экспозиции клеток на RPM. Таким образом, многомерная рандомизация положения культуры клеток относительно вектора гравитации с помощью RPM значительно ухудшала эффективность начальных этапов остеобластической фенотипической трансформации ММСК.

А Б

Рис. 12. Индуцированная экспрессия щелочной фосфатазы. А - экспозиция 10 суток, Б - 20 суток. (M±m, данные четырех независимых экспериментов, в каждом из которых анализировали 5-10 тыс кл., p<0,05^* - различия достоверны по сравнению с шейкером, критерий Манна-Уитни). СК - статический контроль, Ш - шейкер. (Кривая С указывает на процентное содержание окрашенных клеток в популяции).

При изучении выработки и структурной организации органического матрикса, образуемого в ходе остеогенной дифференцировки ММСК, было обнаружено, что у клеток, культивировавшихся в течение 10 суток в среде с остеогенными стимулами в статических условиях и на шейкере, коллагеновый матрикс был хорошо структурирован, отчетливо проявлялась его характерная зигзагообразная организация. В то же время, островки коллагенового матрикса практически отсутствовали при экспозиции клеток на RPM на тех же временных сроках. Интересно, что к 20-м суткам культивирования клеток в остеогенной среде описанные различия в структурной организации коллагенового матрикса между контрольными и опытными культурами немного сглаживались, но полностью не исчезали (Рис.13).

А Б

Рис. 13. Структурная организация внеклеточного коллагенового матрикса в культурах остеогенных производных ММСК. А - экспозиция 10 суток; Б - экспозиция 20 суток (а, в - статический контроль; б, г - RPM). Ув.х200.

При оценке поздних этапов остеогенной дифференцировки в культурах ММСК, последовательно прошедших все этапы остеогенеза при их экспозиции на RPM, при общем достаточно низком уровне кальцификации матрикса во всех экспериментальных группах между ними не было выявлено значимых отличий. Изучение формирования очагов кальцификации в культурах престимулированных остеогенных производных ММСК показало, что минерализация матрикса на определенных сроках экспозиции на RPM в культурах полностью отсутствует (Рис. 14, А). Мелкие островки кальциевого вещества обнаруживались в опытных культурах на гораздо более поздних этапах культивирования. В контрольных группах клеток в это же время очаги кальциевой минерализации сливались друг с другом, в результате чего до ~99% площади поверхности клеточных культур было «замуровано» в минерализованное межклеточное вещество, то есть процесс остеогенной дифференцировки клеток был на завершающих стадиях (Рис. 14, Б). Интересно, что примерно такая же картина наблюдалась и в культурах остеобластов, которые экспонировали на RPM c одновременной остеогенной стимуляцией, с той лишь разницей, что сам процесс формирования минерализованного матрикса происходил у них в более короткие сроки (Рис.14, С).

Таким образом, длительная экспозиция клеток различного уровня коммитированности на RPM приводила подавлению конечных этапов индуцированного остеогенеза как остеогенных производных ММСК, так и остеобластов, что, вероятно, свидетельствует об универсальном характере клеточных реакций на пребывание в условиях моделирования эффектов микрогравитации.

(А) Остеогенные производные ММСК

(Б) Остеогенные производные ММСК

(С) Остеобласты

Рис.14. Минерализация внеклеточного матрикса солями кальция, образованная в ходе индуцированной остеогенной дифференцировки остеогенных производных ММСК и остеобластов в условиях моделирования эффектов микрогравитации с помощью RPM. А,С - экспозиция 20 суток, Б - экспозиция 30 суток (а, г, и - статический контроль; б, д, к - шейкер; в, е, л - RPM). Ув.х100.

Рис.15. Морфология адипоцитоподобных клеток, образованных в ходе адипогенеза адипогенных производных ММСК в условиях моделирования эффектов микрогравитации с помощью RPM в течение 10 суток. а - статический контроль, б - шейкер, в - RPM. Ув.х100.

Рис.16. Эффективность индуцированного адипогенеза ММСК (а) и адипогенных производных ММСК костного мозга человека (б) в условиях моделирования эффектов микрогравитации с помощью RPM. (Репрезентативные данные, представлено среднее значение числа клеток в поле зрения и стандартное отклонение среднего, n=10), СК - статический контроль, Ш - шейкер.

Исследования показали, что морфологические характеристики адипоцитоподобных клеток и эффективность индуцированной адипогенной дифференцировки ММСК, а также их престимулированных производных после 20 суток воздействия адипогенных стимулов не изменялись при экспозиции клеток в условиях моделирования эффектов микрогравитации с помощью RPM (Рис. 15, 16).

Таким образом, несмотря на некоторые теоретические предпосылки, свидетельствующие о возможности активации адипогенной дифференцировки ММСК в условиях микрогравитации [Zayzafoon et al., 2004], на основании полученных данных можно заключить, что индуцированная адипогенная дифференцировка ММСК в отличие от индуцированной остеогенной дифференцировки не изменяется при моделировании эффектов микрогравитациии.

ВЫВОДЫ

1) Подобраны оптимальные режимы культивирования и индукции дифференцировки мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека (ММСК) и коммитированных клеток-предшественников на горизонтальном клиностате и Устройстве для рандомизации положения (RPM), которые позволяют воспроизводить эффекты влияния микрогравитации на культивируемые клетки в наземных условиях.

2) Моделирование эффектов микрогравитации приводит к изменению кинетики роста ММСК, а также коммитированных к остеогенезу клеток-предшественников. Прирост количества клеток после 72 часов экспозиции достоверно снижается в 4 - 6 раз при клиностатировании и в 1,6 - 2 раза при рандомизации положения культуры клеток с помощью RPM.

3) В условиях длительного моделирования эффектов микрогравитации (20 суток) ММСК и их остеогенные производные сохраняют экспрессию основных поверхностных антигенов стромальных клеток - CD29, CD90, CD44 и не экспрессируют гемопоэтические маркеры - CD34, CD45, HLA DR. Доля клеток, экспрессирующих рецептор адгезии CD106 значительно уменьшается при остеогенной дифференцировке ММСК. При коммитировании ММСК к остеогенезу моделирование эффектов микрогравитации с помощью RPM, но не клиностата, приводит к увеличению числа клеток, экспрессирующих HLA A,B,C.

4) Длительное моделирование эффектов микрогравитации приводит к возрастанию (1,7 - 3,2 раза) продукции интерлейкина-8 в культурах ММСК и их остеогенных производных, при этом моделирование эффектов микрогравитации с помощью RPM стимулирует продукцию ИЛ-8 на более ранних этапах экспозиции.

5) При коммитировании ММСК к остеогенезу в условиях моделирования эффектов микрогравитации с помощью RPM наблюдается достоверное уменьшение числа клеток, экспрессирующих щелочную фосфатазу, что свидетельствует о подавлении начальных этапов дифференцировки ММСК в остеобласты.

6) В условиях длительного моделирования эффектов микрогравитации ухудшается «качество» основных структурных компонентов костного матрикса. В ходе коммитирования ММСК к остеогенезу замедляется выработка коллагена I типа клетками, что сопровождается последующими изменениями в структурной организации органического матрикса. При экспозиции более дифференцированных остеогенных клеток снижается уровень кальциевой минерализации матрикса.

7) Длительное моделирование эффектов микрогравитации не влияет на эффективность индуцированной адипогенной дифференцировки ММСК и коммитированных адипогенных производных ММСК.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

* Для моделирования эффектов микрогравитации в наземных условиях рекомендуется использование Устройства для рандомизации положения культуры клеток относительно вектора земной гравитации - Random Positioning Machine (RPM).

* Для изучения молекулярно-клеточных механизмов дифференцировки стволовых клеток и остеогенных клеток-предшественников рекомендуется применять способ рандомизации положения объекта относительно вектора земной гравитации с помощью RPM, который имеет преимущество перед горизонтальным клиностатированием за счет меньшего вклада посторонних факторов, таких как перемешивание среды культивирования и действие центробежных сил, и более эффективной имитации влияния микрогравитации на культивируемые клетки-предшественники.