-
Противовирусные препараты, механизмдействия.
Противовирусные препараты — соединения природного или синтетического происхождения, применяющиеся для лечения и профилактики вирусных инфекций. Действие многих из них избирательно направлено на различные стадии развития вирусной инфекции и жизненного цикла вирусов.
Основные механизмы действия противовирусных препаратов
-На стадии заражения вирус адсорбируется на клеточной мембране и проникает в клетку. В этот период применяются препараты, нарушающие этот процесс: растворимые ложные рецепторы, антитела к мембранным рецепторам, ингибиторы слияния вируса с клеточноймембраной.
-На стадии пенетрации вируса, когда происходит депротеинизация вириона и «раздевание» нуклеопротеида, эффективны блокаторы ионных каналов и стабилизаторы капсида.
-На следующем этапе начинается внутриклеточный синтез вирусных компонентов. На этом этапе эффективны ингибиторы вирусных ДНК-полимераз, РНК-полимераз, обратной транскриптазы, геликазы, праймазы, интегразы. На трансляцию вирусных белков действуют интерфероны (ИФН), антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы и ингибиторы регуляторных белков. На протеолитическое расщепление воздействуют ингибиторы протазы.
ИФН и ингибиторы структурных белков активно воздействует на сборку вируса.
-Заключительный этап репликационного цикла включает выход дочерних вирионов из клетки и гибель инфицированной клетки-хозяина. На этом этапе эффективны ингибиторы нейраминидазы, противовирусные антитела и цитотоксические лимфоциты.
По механизму действия (оставила две классификации на всякий случай, эта более полная):
-
Препараты, ингибирующие процесс проникновения вируса в клетку и его депротеинизацию:
• синтетический амин (амантанин), который специфически ингибирует вирус гриппа типа А, нарушая процес «раздева ния» вируса, взаимодействуя с матриксны белком;
• искусственно синтезированные пептиды, в частности пептид 36 аминокислот (энфувиртид), ингибирующий процесс слияния мембраны клетки и ВИЧ-1, путем изменения конформации трансмембранного белк gp41
-
Препараты, ингибирующие процесс репликации вирусных нуклеиновых кислот (по большей мере аналоги нуклеозидов). Некоторые из них (йодоксиуридин) могут действовать как антиметаболиты, встраиваясь в вирусную нуклеиновую кислоту в процессе репликации и таким образом обрывая дальнейшую элонгацию цепи. Другие препараты действуют как ингибиторы вирусных полимераз (активны в фосфорилированной форме). К препаратам, избирательно действующим на вирусную полимеразу, относитсч аналог гуанозина- ацикловир. Фосфорилирование ацикловира наиболе эффективно осуществляется вирусной тимидинкиназой, которая имеется у вирусов простого герпеса I и II типа, в отношении которых активен этот препарат. Еще ингибиторы: аналог тимидина- видарабин, ненуклеозидные производные ( аналог неорганического пирофосфата- фоскарнет, который, связывая полифосфатные группы ДНК-полимераз вируса, блокирует элонгацию молекулы ДНК. Активен в отношении вирусов гепатит В, цитомегаловирусов, ВИЧ-1.)
Препараты, ингибируюшие процесс формирования новых вирионов
1. Производные тиосемикарбизонов (метисазон) блокирует поздние стадии вирусной репликации, вызывая образование несформировавшихся неинфекционных вирусных частиц. Активен в отношении вирус анатурально оспы.
2. Ингибиторы вирусных ферментов. К ним относятся синтетические пептиды, которые, внедряясь в активный центр фермента, подавляют его активность. К этой группе препаратов относится ингибитор вирусной нейраминидазы вирусов гриппа А и В оселтамивир. В результате действия ингибиторов нейраминидазы не происходит отпочковывание новых вирионов из клетки.
— метод диффузии в агар. На агаризованную питательную среду засевают исследуемую чистую культуру микроба, а затем вносят антибиотики. Обычно препарат вносят или в специальные лунки в агар (количественный метод), или на поверхности посева раскладывают диски с антибиотиками (метод дисков — качественны метод). Результаты учитывают через сутки по наличию или отсутствию роста микробов вокруг лунок (дисков);
— метод определения минимальных ингибирующих (МИК) и бактерицидных (МБК) концентраций, т.е. минимальный уровень антибиотика, который позволяетinvitro предотвратить видимый рост микробов в питательной среде или полностью ее стерилизует. Это количественные методы, которые позволяют рассчитать дозу препарата, так как при лечении концентрация антибиотика в крови должна быть значительно выше МИК для возбудителя инфекции. Введение адекватных доз препарата необходимо для эффективного лечения и профилактики формирования устойчивых микробов. Существуют ускоренные способы с применением автоматических анализаторов.
Метод серийных разведений
Методом серийных разведений МИК определяют по минимальной концентрации антибиотика, задерживающей видимый рост микроорганизма в пробирках (макрометод), лунках планшета (микрометод) или на чашках с питательной средой, содержащих убывающие концентрации антибиотика. Например, для определения МИК тетрациклина в отношении культуры Staphylococcusaureus, выделенной от больного, готовят двукратно убывающие концентрации этого антибиотика в стандартном питательном бульоне (Бульон Мюллера-Хинтона). Контролями культуры и антибиотика являются, соответственно, бульон без антибиотика и бульон с первым разведением антибиотика. В опытные и контрольные пробирки вносят стандартизованную суспензию молодой агаровой культуры S. aureus и после суточной инкубации учитываютрезультат.
Учетным признаком является наличие или отсутствие мутности бульона (роста культуры) в пробирках.
В контроле культуры должна быть мутность, в контроле антибиотика - нет. Величина МИК соответствует той минимальной концентрации тетрациклина, при которой отсутствует мутность (бульон в пробирке прозрачен). Допустим, бульон будет мутным в опытных пробирках с концентрациями 1, 2, 4 и 8 мкг/мл, а в пробирках с концентрациями 16, 32 и 64 мкг/мл прозрачным. В этом случае МИК тетрациклина = 16 мкг/мл. Известно, что величина К тетрациклина при введении среднетерапевтических доз - 4 мкг/мл (при использовании максимальных доз - 10 мкг/мл). Следовательно, в данном случае терапевтический индекс будет равен Т = 16:4 = 4 (> 0,3), т.е. возбудитель устойчив к антибиотику и лечение тетрациклином не даст антимикробного эффекта в отношении S. aureus у данного больного, даже при введении максимальных доз (Т = 16:10 = 1,6). Серийные разведения в плотных средах (Агар Мюллера-Хинтона, М173) чаще используют для одновременного тестирования большого количества микробных штаммов (для посева можно использовать специальный штамп-репликатор). Учетным признаком в этом случае является наличие или отсутствие роста на поверхностиагара.
Метод серийных разведений нередко считают наиболее точным, хотя и относительно трудоемким, дорогим. В действительности, при правильной постановке и соответствующих контролях диффузионные методы в ряде случаев не уступают ему по точности. Вместе с тем методом серийных разведений можно тестировать чувствительность более широкого круга микроорганизмов (включая анаэробные, медленно-растущие и прихотливые).
Диско-диффузионный метод
При определении чувствительности методом диффузии в агар чистую культуру возбудителя засевают «газоном» на питательный агар в чашке, например, тампоном, смоченном в стандартизованной (108 КОЕ/мл) суспензии микроорганизма. Затем на поверхность агара укладывают стандартные бумажные диски, пропитанные антибиотиками, которые диффундируют в агар, создавая градиент концентрации. На чашку диаметром 90 мм равномерно укладывают 6-7 дисков. После инкубирования в термостате измеряют диаметры зон задержки роста вокруг дисков и по специальным таблицам определяют степень чувствительности к тому или иному антибиотику
Существует линейная связь между логарифмом МИК, измеренной при использовании метода серийных разведений, и диаметром зоны задержки роста при использовании диско-диффузионного метода
Поскольку для получения результатов методом диффузии в агаре используют стандартизованные условия (состав и количество среды, количество засеваемых микробов, температура и сроки инкубирования, стандартные диски и др.), каждому значению диаметра зоны вокруг диска с антибиотиком соответствует определенное значение МИК. Исходя из значения МИК, можно определить терапевтический индекс: Т=МИК/К (см. выше). Следовательно, по диаметру зоны можно определить степень чувствительности к тому или иному антибиотику: чувствительные (S), умеренно-устойчивые (I) и устойчивые(R).
К категории S (от англ. sensitive, чувствительный) относят те, для которых использование средних терапевтических доз будет достаточным для трехкратного превышения МИК.
В категорию I (от англ. intermediate, промежуточный) относят те микробы, для подавления которых потребуются максимальные терапевтические дозы.
Категорию R (от англ. resistant, устойчивый) составляют те микроорганизмы, в отношении которых данный антибиотик будет неэффективным invivo (см. выше).
Таким образом, определение антибиотико-чувствительности методом серийных разведений и диско- диффузионным методом основаны на одном принципе - сравнении величины МИК для данного микроба со средней концентрацией антибиотика в сыворотке крови. Различие в том, что в первом случае МИК определяют непосредственно в опыте, а во втором случае определяют величину зоны задержки роста, как эквивалент МИК, поэтому цепочка расчетов несколько длиннее: диаметр- МИК-Т-категория чувствительности. Диско-диффузионный метод более прост, дешев и гибок в работе, хотя и имеет свои ограничения (см.ниже).
Другие методы
Промежуточное положение между двумя вышеописанными методами занимает метод определения чувствительности с помощью Е-тестов (E-test). Последние представляют собой бумажные полоски, пропитанные не одной, а рядом убывающих концентраций определенного антибиотика (128, 64, 32, 16, 8, 4, ...мкг/мл). Е-тесты, подобно дискам при диско-диффузионном методе, укладывают на поверхность стандартного питательного агара, засеянного испытуемой культурой в виде «газона».
Врезультате диффузии антибиотик формирует в агаре эллипсовидную зону градиента концентраций:более широкую в области высоких концентраций и более узкую — в области низких. После инкубирования вокруг полоски формируется эллипсовидная зона задержки роста, которая, сужается в области малых концентраций и «пересекает» полоску на уровне, соответствующем величине МИК. Тот же принцип используется при определении чувствительности методом стрипов ХайКомб (см. ниже).
При массовых исследованиях используют автоматизированные методы определения чувствительности к антибиотикам. Это позволяет упростить и ускорить проведение исследования. Наиболее часто применяют метод серийных разведений в планшетах и метод пограничных концентраций (микрометоды). В первом случае, как правило, используют готовые стерильные полистироловые 96-луночные планшеты, в лунки которых внесены лиофильно высушенные в бульоне убывающие концентрации антибиотиков. После вскрытия планшета стандартизованную суспензию испытуемой культуры в одинаковой дозе (например, 0,1 мл) асептически вносят в соответствующие ряды лунок