, закрывают крышкой и инкубируют при оптимальной температуре. После инкубирования отмечают рост (помутнение бульона) в тех лунках планшета, где антибиотик не действует. При наличии помутнения бульона в контроле культуры и опытных лунках определяют величину МИК. Учет можно вести как визуально, так и с помощью специальных микробиологических анализаторов. В этих приборах имеется возможность автоматизации основных действий: внесения культуры, инкубирования, встряхивания, определения оптической плотности (степени мутности) жидкости в каждой лунке, графическое отображение результатов (в том числе в динамике), определение степени чувствительности и печать протоколаисследования.
Метод пограничных концентраций можно считать усеченным методом серийных разведений. В соответствии с ним испытуемую культуру вносят только в две лунки (пробирки), где находятся высокая (С) и низкая (с) концентрации антибиотика. Концентрация «С» соответствует границе между устойчивыми и умеренно-устойчивыми штаммами, а концентрация «с»- границе между умеренно-устойчивыми и чувствительными штаммами. Если после инкубирования рост отсутствует в обеих лунках, штамм относят к чувствительным, если только в лунке с концентрацией «С»-к умеренно-устойчивыми штаммам, а если в обеих лунках имеется рост, штамм относят к устойчивым. Результат этого исследования имеет качественное (полуколичественное) выражение, но само исследование отличается простотой и экономичностью. Иногда вместо 2 концентраций используют одну или более 2 (неполный рядразведений).
Многие модификации метода серийных разведений сводятся к способу учета результата: колориметрическое, турбидиметрическое, флюорометрическое исследование и др. Оригинальный диско-диффузионный метод, описанный в 1966 г., хорошо стандартизован и широко используется для количественной оценки. Он рекомендован Всемирной Организацией Здравоохранения (с незначительными модификациями) в качестве референс-теста, которым следует пользоваться при рутинной работе в клинической лаборатории.
Антибиотикорезистентность — это устойчивость микробов к антимикробным химиопрепаратам. Бактерии следует считать резистентными, если они не обезвреживаются такими концентрациями препарата, которые реально создаются в макроорганизме. Резистентность может быть природной и приобретенной.
Природная устойчивость. Некоторые виды микробов природно устойчивы к определенным семействам антибиотиков или в результате отсутствия соответствующей мишени (например, микоплазмы не имеют клеточной стенки, поэтому не чувствительны ко всем препаратам, действующим на этом уровне), или в результате бактериальной непроницаемости для данного препарата (например, грамотрицательные микробы менее проницаемы для крупномолекулярных соединений, чем грамположительные бактерии, так как их наружная мембрана имеет «маленькие» поры).
Приобретенная устойчивость. Приобретение резистентности — это биологическая закономерность, связанная с адаптацией микроорганизмов к условиям внешней среды. Она, хотя и в разной степени, справедлива для всех бактерий и всех антибиотиков. К химиопрепаратам адаптируются не только бактерии, но и остальные микробы — от эукариотических форм (простейшие, грибы) до вирусов. Проблема формирования и распространения лекарственной резистентности микробов особенно значима для внутрибольничных инфекций, вызываемых так называемыми «госпитальными штаммами», у которых, как правило, наблюдается множественная устойчивость к антибиотикам (так называемая полирезистентность).
Генетические основы приобретенной резистентности. Устойчивость к антибиотикам определяется и поддерживается генами резистентности (r-генами) и условиями, способствующими их распространению в микробных популяциях. Приобретенная лекарственная устойчивость может возникать и распространяться в популяции бактерий в результате:
-
мутаций в хромосоме бактериальной клетки с последующей селекцией (т. е. отбором) мутантов. Особенно легко селекция происходит в присутствии антибиотиков, так как в этих условиях мутанты получают преимущество перед остальными клетками популяции, которые чувствительны к препарату. Мутации возникают независимо от применения антибиотика, т. е. сам препарат не влияет на частоту мутаций и не является их причиной, но служит фактором отбора. Далее резистентные клетки дают потомство и могут передаваться в организм следующего хозяина (человека или животного), формируя и распространяя резистентные штаммы. Мутации могут быть: 1) единичные (если мутация произошла в одной клетке, в результате чего в ней синтезируются измененные белки) и 2) множественные (серия мутаций, в результате чего изменяется не один, а целый набор белков, например пенициллинсвязывающих белков у пенициллин-резистентногопневмококка);
-
переноса трансмиссивных плазмид резистентности (R-плазмид). Плазмиды резистентности (трансмиссивные) обычно кодируют перекрестную устойчивость к нескольким семействам антибиотиков. Впервые такая множественная резистентность была описана японскими исследователями в отношении кишечных бактерий. Сейчас показано, что она встречается и у других групп бактерий. Некоторые плазмиды могут передаваться между бактериями разных видов, поэтому один и тот же ген резистентности можно встретить у бактерий, таксономически далеких друг от друга. Например, бета-лактамаза, кодируемая плазмидой ТЕМ-1, широко распространена у грамотрицательных бактерий и встречается у кишечной палочки и других кишечных бактерий, а также у гонококка, резистентного к пенициллину, и гемофильной палочки, резистентной кампициллину;
-
переноса транспозонов, несущих r-гены (или мигрирующих генетических последовательностей). Транспозоны могут мигрировать с хромосомы на плазмиду и обратно, а также с плазмиды на другую плазмиду. Таким образом, гены резистентности могут передаваться далее дочерним клеткам или при рекомбинации другимбактериям-реципиентам.
-
экспрессии генных кассет интегронами. Интегрон — это генетические элементы, которые содержат в себе ген интегразы, специфический сайт интеграции и рядом с ним промотор, что придает им способность интегрировать в себя мобильные генные кассеты (например, содержащие гены резистентности) и экспрессировать присутствующие в них беспромоторные гены.
Реализация приобретенной устойчивости. Изменения в геноме бактерий приводят к тому, что меняются и некоторые свойства бактериальной клетки, в результате чего она становится устойчивой к антибактериальным препаратам. Обычно антимикробный эффект препарата осуществляется таким образом: агент должен связаться с бактерией и пройти сквозь ее оболочку, затем ондолжен быть доставлен к месту действия, после чего препарат взаимодействует с внутриклеточными мишенями. Реализация приобретенной лекарственной устойчивости возможна на каждом из следующих этапов:
-
модификация мишени. Фермент-мишень может быть так изменен, что его функции не нарушаются, но способность связываться с химиопрепаратом (аффинность) резко снижается или может быть включен «обходной путь» метаболизма, т. е. в клетке активируется другой фермент, который не подвержен действию данногопрепарата.
-
«недоступность» мишени за счет снижения проницаемости клеточной стенки и клеточных мембран или «эффлюко»- механизма, когда клетка как бы «выталкивает» из себяантибиотик.
-
инактивация препарата бактериальными ферментами. Некоторые бактерии способны продуцировать особые ферменты, которые делают препараты неактивными (например, бета-лактамазы, аминогликозид-модифицирующие ферменты, хлорамфениколацетилтрансфераза). Бета-лактамазы — это ферменты, разрушающие бета-лактамное кольцо с образованием неактивных соединений. Гены, кодирующие эти ферменты, широко распространены среди бактерий и могут быть как в составе хромосомы, так и в составеплазмиды.
Для борьбы с инактивирующим действием бета-лактамаз используют вещества — ингибиторы (например, клавулановую кислоту, сульбактам, тазобактам). Эти вещества содержат в своем составе бета-лактамное кольцо и способны связываться с бета- лактамазами, предотвращая их разрушительное действие на бета-лактамы. При этом собственная антибактериальная активность таких ингибиторов низкая. Клавулановая кислота ингибирует большинство известных бета-лактамаз. Ее комбинируют с пенициллинами: амоксициллином, тикарциллином, пиперациллином.
Предупредить развитие антибиотикорезистентности у бактерий практически невозможно, но необходимо использовать антимикробные препараты таким образом, чтобы не способствовать развитию и распространению устойчивости (в частности, применять антибиотики строго по показаниям, избегать их использования с профилактической целью, через 10—15 дней антибиотикотерапии менять препарат, по возможности использовать препараты узкого спектра действия, ограниченно применять антибиотики в ветеринарии и не использовать их как фактор роста).
67. Микроэкология полости рта. Состояние микробиома в норме и при патологии полости ртаМикрофлора полости рта (син. микробиоценоз полости рта) – совокупность представителей различных таксономических групп микроорганизмов, населяющих полость рта как своеобразную экологическую нишу организма человека, вступающих в биохимические, иммунологические и прочие взаимодействия с макроорганизмом и друг с другом.
Микрофлора полости рта подразделяется на аутохтонную (резидентную, постоянную) и аллохтонную (транзиторную, временную). К резидентной группе относят микробы, максимально приспособленные к существованию в условиях макроорганизма и поэтому присутствующие в данном биотопе постоянно. Они содержатся в довольно высоких концентрациях, выполняют определённые функции и играют существенную роль в активации метаболических процессов организма хозяина.
Аутохтонную микрофлору подразделяют на облигатную, которая постоянно обитает в полости рта, и факультативную, в составе которой чаще встречаются условно-патогенные бактерии. Факультативные виды встречаются реже, они наиболее характерны для отдельных заболеваний зубов, пародонта, слизистой оболочки полости рта и губ. Транзиторную группу составляют микроорганизмы, которые неспособны к длительному существованию в организме человека и поэтому являются необязательными компонентами микробиоценоза полости рта.
Частота их встречаемости и концентрация в данном биотопе определяется поступлением микробов из окружающей среды и состоянием иммунной системы организма хозяина. При этом их содержание и удельный вес у здоровых людей не превышает аналогичные показатели резидентных микроорганизмов.
Условиями для размножения и длительной задержки микроорганизмов в полости рта являются: температурный оптимум, обилие влаги, близкая к нейтральной реакция среды, анатомические особенности, способствующие накоплению микробных клеток.
Роль нормальной микрофлоры полости рта:
1. стимулирует развитие лимфоидной ткани
2. благодаря антагонистическому воздействию подавляет размножение различных патогенных видов бактерий, попадающих в полость рта.
Микробы нормофлоры могут подавлять размножение других видов и родов бактерий за счёт более высокого биологического потенциала(короткая lag-фаза, более высокая скорость размножения), конкуренции за источник питания, путём изменения рН, продукции спиртов, перекиси водорода, молочной и жирных кислот и т.д. Представители нормальной микрофлоры синтезируют лизоцим, ацидофиллин, бактериоцины, обладающие бактерицидной активностью по отношению к чужеродным микроорганизмам
3. поддерживает физиологическое воспаление в слизистой оболочке и повышают готовность к иммунным реакциям
4. обеспечивает самоочищение ротовой полости
5. способствует снабжению организма аминокислотами и витаминами, которые секретируются м/о в процессе метаболизма
6. продукты жизнедеятельности микроорганизмов могут стимулировать секрецию слюнных и слизистых желез
7. являются возбудителями и главными виновниками основных стоматологических заболеваний.
Доминирующее место как по разнообразию обитающих в полости рта видов, так и по количеству занимают бактерии, хотя в состав микрофлоры полости рта входят также вирусы, грибы и простейшие. Число видов бактерий,