Заканчивая этот раздел, считаю своим долгом упомянуть о некоторых недостатках, присущих большинству методов, основанных на ВГ. Во-первых, ПЦР амплификация может исказить исходную картину распределения различных фрагментов ДНК в смеси благодаря эффекту ПЦР селекции в случае, когда используется слишком много циклов ПЦР (этот эффект упомянут выше в разделе 1.2.3). Вторая проблема заключается в том, что ВГ в ряде случаев не может дискриминировать различных представителей эволюционно молодых генных семейств, обладающих значительной гомологией первичной структуры. Похожая проблема возникает как на уровне геномной ДНК, так и для кДНК, когда исследуются геномные повторы. Наконец, «незначительные» изменения в экспрессии генов, то есть таковые менее одного порядка величины, обычно с трудом детектируются при использовании ВГ.
1.3 Поиск общих последовательностей: метод клонирования совпадений
В отличие от вычитающей гибридизации, задача которой - поиск дифференциальных последовательностей, присутствующих в образце, называемом трейсер, и отсутствующих в другом образце, называемом драйвер, подход, называемый “coincidence cloning” (CC; Глава 5) был разработан для нахождения общих последовательностей среди анализируемых образцов. Подход основан на клонировании идентичных нуклеотидных последовательностей, принадлежащих к различным пулам фрагментированной геномной ДНК или кДНК, и избавлении от всех остальных последовательностей (73). Сопоставляя фрагменты геномной ДНК с фрагментами какого-либо сходным образом фрагментированного локуса (клонированного в форме BAC, космиды, и т.п.), можно отобрать и клонировать геномные фрагменты, принадлижащие данному локусу.
Для этого оба образца сравниваемой ДНК фрагментируют, как-либо помечают (например, введением различных адапторных олигонуклеотидов), смешивают, денатурируют и гибридизуют, а затем выделяют дуплексы, имеющие обе специфические «метки», то есть гетерогибриды обоих образцов, соответствующие общим последовательностям. Последняя стадия является ключевой для всего процесса, поскольку эффективное выделение правильных гибридных молекул необходимо для создания СС библиотек, подлинно обогащённых общими последовательностями. Ранние версии техники СС были низко эффективны. Их самым серьёзным недостатком была низкая селективность, благодаря которой в итоговых библиотеках содержалось значительное количество фрагментов, уникальных для того или иного образца. Для улучшения этой ситуации, Ажикина и др. применили метод селективной супрессии ПЦР (упомянут в разделе 1.2.4, детально рассмотрен в Главе 2), что сильно повысило эффективность CC (74-76).
На рисунке 1.9 представлена простая модель использования метода coincidence cloning для поиска эволюционно консервативных последовательностей, содержащихся в сравниваемых геномах, предложенная в работе Чалой и др. Геномные ДНК человека и мармозетки были расщеплены часто щепящими эндонуклеазами рестрикции, а затем к ним были лигированы два различных набора супрессионных адапторов. Образцы смешали, денатурировали и гибридизовали, а затем достроили концы при помощи ДНК полимеразы, (Рис. 1.9) и обработали нуклеазами, специфичными к неспаренным нуклеотидам (77). Такие нуклеазы узнают неспаренные либо же неверно спаренные нуклеотиды в составе двуцепочечных ДНК и разрезают подобные «неправильные» гибриды, тем самым значительно повышая эффективность всего процесса. На следующей стадии, продукты гибридизации амплифицируют с праймерами, специфичными к последовательностям использованных супрессионных адапторов, так что в модельном эксперименте амплифицировались лишь гибридные молекулы ДНК человека и Callithrix pigmaea. В результате была создана геномная библиотека, высоко обогащённая эволюционно консервативными последовательностями, сохраняющимися в геномах человека и Callithrix pigmaea.
Рисунок 1.9. Схема метода Mispaired DNA Rejection (MDR). Принцип метода - это специфическая энзиматическая деградация несовершенных дуплексов в растворе (стадия V), что приводит к значительному снижению фоновой гибридизации. Метод был эффективен в том числе для сложных геномных смесей, таких, как ДНК приматов.
Ещё одним успешним вариантом техники клонирования совпадений является новый метод, названный “Non-methylated genomic sites coincidence cloning (NGSCC)”, который позволяет получить набор последовательностей, относящихся к интересующему геномному локусу и содержащих неметилированные сайты CpG. Метод основан на фрагментации исходных образцов ДНК эндонуклеазами рестрикции, чувствительными к метилированию. Для упрощения геномной гибридизационной смеси, ДНК дополнительно фрагментируется часто щепящим ферментом, не чувствительным к метилированию, например AluI. В результате, размер фрагментов оказываются в диапазоне, оптимальном для ПЦР амплификации (то есть в пределах до 1.5 тпн. Затем различные супрессионые адапторы лигируют к липким концам, образованным метил-чувствительным ферментом, и к тупым концам, созданным AluI. Дальнейшая ПЦР амплификация с праймерами, специфичными для обоих использованных адапторов, приводит к получению ампликона геномных фрагментов, обладающих неметилированным сайтом CpG с одной стороны и ограниченных рестриктным сайтом AluI с другой.
Затем ампликон гибридизуют с фрагментированной ДНК интересующего геномного локуса, к которой предварительно были лигированы адапторы третьего типа (в своих экспериментах авторы метода анализировали профили метилирования геномного локуса 19 хромосомы человека D19S208-COX7A1 длиной около 1 млн. пар оснований). В ходе последующей ПЦР амплифицируются только те неметилированные CpG-содержащие фрагменты, которые относятся к локусу D19S208-COX7A1. Секвенирование соответствующих клонотек, полученных для нормальных и опухолевых тканей, позволило авторам создать для этого локуса первую полную крупномасштабную карту участков метилирования, включая её ткане- и опухоль-специфические варианты (75). Позднее, та же группа авторов объединила методы NGSCC и SAGE, создав методику, названную “RIDGES”. Эта методика более информативна, чем NGSCC, поскольку на выходе получается в 10-20 раз больше информации о сайтах метилирования при расчёте на один отсеквенированный клон, что обеспечивается технологией SAGE (74).
Впрочем, использование метода coincidence cloning не ограничивается анализом геномной ДНК. В частности, недавно опубликованный подход, названный “genomic repeat expression monitor (GREM)” использует принцип метода coincidence cloning для поиска общих последовательностей среди пре-амплифицированных 3'-концевых локусов, фланкирующих геномные повторяющиеся элементы, и набором 5'-концевых фрагментов кДНК, что приводит к созданию гибридной библиотеки геномной ДНК/кДНК, обогащённой промоторно-активными повторами. Это позволяет создать исчерпывающую полногеномную карту промоторно-активных повторяющихся элементов генома (78). Эти и другие применения метода CC будут подробно описаны в Главе 5.
1.4 Гибридизация в растворе для поиска геномных полиморфных участков
В отличие от вычитающей гибридизации, которая направлена на поиск относительно длинных дифференциальных фрагментов, следующая группа методов используется для поиска небольших, порядка единиц нуклеотидных замен, различий между сравниваемыми образцами ДНК. Исследование мутаций позволяет выявлять нормальные функции генов, белков, некодирующих РНК, причины многих заболеваний, а также исследовать вариабильность индивидуальных ответов на сигнал среди популяций. Многие однонуклеотудные полиморфизмы (SNP) не являются вредными сами по себе, но могут быть сцеплены с мутантными аллелями, связанными с генными заболеваниями или спецификой ответа на определённые лекарственные средства.
Тому огромному количеству исследователей, работающему в данной области, уже удалось найти десятки миллионов SNP за последние годы. Однако же, это число представляется ничтожным в сравнении с реальными количествами SNP и других мутаций, присутствующими в геномах. Идеальный метод детекции мутаций и SNP должен быть способен отыскивать мутации в больших фрагментах ДНК и картировать их с точностью до нуклеотида; при этом такой метод был бы чувствительным, надёжным и производительным. На настоящее время, для детекции мутаций применяют множество химических, энзиматических, биоинформационных и физических методов. Многие методы позволяют быстро и эффективно определить нприсутствие мутации в интересующем геномном участке, но не позволяют дать характеристику этой мутации и точно определить её локализацию. Другая группа методов позволяет проводить точное картирование мутаций, но дорогим и трудоёмким способом. Семейство новых подходов для детекции мутаций, основанных на гибридизации ДНК в растворе, сочетает в себе высокую производительность, экономичность, надёжность и детальную характеристику мутаций (детально рассмотрено в Главе 6).
В настоящее время, поиск мутаций при помощи секвенирования ДНК по Сэнгеру принято за эталонный подход. При этом, необходимо учесть, что хотя это и является единственным способом точной характеристики мутации, но не является лучшим способом детекции мутаций и скрининга большого количества образцов. Тот факт, что многие методы сканирования мутаций практически моментально способны детектировать присутствие 5-10% мутантных молекул на фоне избытка молекул дикого типа, доказывает преимущество таких подходов перед секвенированием, по крайней мере для некоторых приложений. Кроме того, биоинформатические подходы позволяют находить большое количество новых SNP при анализе геномных баз данных.
Впрочем, эти методы требуют предварительной информации, обычно получаемой при секвенировании ДНК, и поиск мутаций в этом случае осуществляется при множественном выравнивании доступных последовательностей. Последние исследования показывают, что лишь небольшая доля всех мутаций может быть найдена таким способом, и многие мутации, в частности, SNP, встречающиеся с низкой частотой, теряются. Становится очевидным, что для детекции таких вариантов требуются высокопроизводительные методы, которые можно было бы применять для скрининга популяций при исследовании, например, сложных генетических заболеваний, при которых затрагиваются протяжённые геномные локусы, большие гены и/или группы генов. Для этих задач были разработаны несколько групп методов. Все они основаны на том, что молекула ДНК, содержащая мутацию, образует неспаренный участок в мутантном сайте при гибридизации с ДНК дикого типа (Рис. 1.10). Таким образом, при гибридизации мутантной ДНК и ДНК дикого типа, образуются два аналогичных неспаренных участка. Детекция и правильное позиционирование этих участков и является ключём к идентификации новых мутаций.
Рисунок 1.10. При гибридизации, мутантные цепи и ДНК дикого типа образуют гетеродуплексы с неспаренными участками, соответствующими точкам мутации.
Такие неспаренные нуклеотиды могут быть идентифицированы прямо или косвенно с использованием самых различных химических, энзиматических или физических подходов, которые характеризуются превосходной эффективностью детекции, соединённой с высокой производительностью и низкой ценой. Следует отметить, что подтверждение новой мутации обязательно требует стадии секвенирования. Однако же в данном случае это секвенирование будет направленным, а не случайным, поиском в чётко определённом геномном локусе, что позволит избежать огромного количества лишней работы. В результате, эти методы снижают стоимость детекции мутации на порядок величины и более. Вкратце, химические подходы основаны на химическом расщеплении неспаренных нуклеотидов, энзиматические используют энзиматическое узнавание несовершенных дуплексов (с дальнейшим связыванием, расщеплением, модификацией или лигированием ДНК по позиции неспаренного нуклеотида), тогда как физические методы детектируют разность в физических характеристиках между мутантными цепями и ДНК дикого типа, будучи основаны либо на физическом выделении несовершенных гибридов ДНК (как электрофоретическое разделение), либо же на поиске различий физических свойств несовершенных и совершенных гибридов ДНК. Все эти методы используют гибридизацию нуклеиновых кислот в растворе и будут подробно описаны в Главе 6.
1.5 Заключение
В этой главе я постарался кратко проиллюстрировать то, как методы гибридизации нуклеиновых кислот в растворе могут быть полезны для большого количества приложений. Был дан краткий обзор основных методических подходов, описанных более детально в других главах.
Широкий спектр экспериментальных задач, решаемых с помощью таких подходов, включает в себя вычитающую гибридизацию, упорядоченный дифференциальный дисплей, метод прогулки по геному, мультиплексная ПЦР, создание библиотек кДНК на основе ничтожно малого количества тотальной РНК, быстрое клонирование концов кДНК (RACE), эффективное выравнивание концентраций редко- и часто-представленных транскриптов в библиотеках кДНК, поиск промоторно-активных повторов и дифференциально метилированной геномной ДНК, идентификация общих последовательностей в образцах геномной ДНК или кДНК, картирование новых генов, поиск эволюционно консервативных последовательностей, а также идентификация и крупномасштабный мониторинг протяжённых и однонуклеотидных мутаций. Разумеется, не существует панацеи, идеального метода, который помог бы разрешить все технические проблемы, стоящие перед исследователем, но комбинирование вышеперечисленных подходов с высокой вероятностью будет полезно для планирования и проведения успешных исследований.
2. Селективная супрессия ПЦр и наиболее популярные приложения этого метода
В этой главе рассматриваются методы, основанные на эффекте супрессии ПЦР (создание библиотек кДНК с использованием малого количества тотальной РНК, супрессионная вычитающая гибридизация, упорядоченный дифференциальный дисплей, метод быстрой амплификации концов кДНК, прогулка по геному, варианты метода Coincidence Cloning, нормализация библиотек кДНК, мультиплексная ПЦР, клонирование in vitro и др.). Вместе эти методы позволяют анализировать сложные образцы кДНК, начиная от поиска интересующих последовательностей до установления полной структуры соответствующих генов.
2.1 Введение
Наиболее важные процессы в самых разнообразных биологических системах (клеточная дифференцировка и морфогенез при эмбриональном развитии и регенерации, апоптоз или раковая трансформация клеток, и т.д.), находятся под контролем специфических регуляторных генов. Для понимания соответствующих молекулярных механизмов, гены, вовлечённые в эти процессы, должны быть выявлены и исследованы. К настоящему моменту, большинство методов молекулярной биологии, вовлечённых решение подобных задач, включают в себя стадию ПЦР, что позволяет работать даже с небольшими количествами биологического материала. Однако же, использование ПЦР требует наличия предварительной информации о последовательности исследуемых образцов ДНК. Когда последовательность интересующих генов частично или полностью неизвестна, прямое использование ПЦР может быть неэффективным.