Курсовая работа (т): Процес біосинтезу аміноглікозидного антибіотика тобраміцину

Протягом ряду років антибіотики небраміцинового комплексу використовувалися також як стимулятори росту, особливо у свинарстві та птахівництві. З метою підвищення ефективності відгодівлі практикується введення в корми дані антибіотики у відносно малих дозах протягом тривалого періоду часу. Застосовувані в годівлі тварин антибіотики надають стимулюючу дію на їх ріст, продуктивність та відтворення, що призводить в середньому до 4-5% збільшення приросту живої маси тварин в порівнянні з контрольними групами, витрати корму на одиницю приросту знижується на 5-8%, активізується резистентність організму, скорочується період відгодівлі тварин. Антибіотики підвищують біологічну повноцінність білків і здатні знижувати потребу в білках тваринного походження. Значною мірою на цьому засноване використання замінників незбираного молока при вирощуванні молодняку тварин. Препарати що містять антибіотики небраміцинового комплексу, введені до раціону птиці, надають стимулюючу дію на її зростання, яйценосність, інкубаційні якості яєць, ефективне використання корму, зниження витрати протеїну [9].

. Використання в медицині

Тобраміцин застосовується при інфекційних захворюваннях, викликаних чутливою мікрофлорою - інфекції жовчовивідних шляхів, кісток і суглобів (остеомієліт), ЦНС (в т. ч. менінгіт), інфекції черевної порожнини (у т. ч. перитоніт), органів дихання (в т . ч. пневмонія, емпієма плеври, абсцес легенів), інфекції шкіри і м'яких тканин (у т. ч. інфіковані опіки), сечовивідних шляхів (у т. ч. пієлонефрит, пієліт, цистит), сепсис, післяопераційні інфекції [7].

В офтальмології даний антибіотик застосовується при бактеріальних нфекціях ока та його придатків. Ці інфекції можуть бути спричинені чутливою мікрофлорою, в т. ч. блефарит, кон'юнктивіт, кератокон'юнктивіт, блефарокон'юнктивіт, кератит, іридоцикліт [7].

Протипоказано застосовувати тобраміцин при гіперчутливості, у т. ч. до інших аміноглікозидів, також при важкій хронічній нирковій недостатність, порушенні функції VIII пари черепних нервів, невриті слухового нерва [ 7].

РОЗДІЛ 3. Характеристика кінцевого продукту − антибіотика тобраміцин

.1 Характеристика тобраміцину

. tenebrarius продукує аміноглікозидний комплекс антибіотика небраміцину, який складається з тобраміцину, канаміцину та апраміцину. Тобраміцин і канаміцин можуть бути гідролізовані в активні форми [15].

Хімічна назва даного антибіотика має такий вигляд: 0-3-Аміно-3-дезокси-альфа-D-глюкопіранозил-(1,6)-0-[2,6-диаміно-2,3,6-тридезокси альфа-D-рибо-гексопіранозил-(1,4)]-2-дезокси-D-стрептамін (у вигляді сульфату). Хімічна фоула - C18H37N5O9 , будову тобраміцину забражено на рис 3.1.

Рис. 3.1. Хімічна будова тобраміцину.

Тобраміцин належить до антибіотиків групи аміноглікозидів. Його особливістю є те, що він легко розчиняється в воді (1:1,5), але слабо розчинний в етанолі (1:2000). Даний антибіотик практично нерозчинний в хлороформі та ефірі [13].

3.2 Фармакологія

Фармакологічна дія - антибактеріальна широкого спектру, бактерицидна. Тобраміцин активно проникає крізь бактеріальну клітинну мембрану. Необоротно зв’язується з одним або більше специфічним рецепторним протеїном із 30S субодиницею бактеріальної рибосоми і взаємодіє з початковим комплексом між переносником РНК і 30S субодиницею. ДНК не може бути прочитана, тому виробляючи нефункціональні протеїни, полірибосоми розщеплюються і втрачають здатність синтезувати протеїн [13].

Це виявляється в прискореному транспортуванні аміноглікозидів, підвищуючи кількість розривів у бактеріальних цитоплазматичних мембранах, що приводить до загибелі клітини. Пригнічує ріст і розвиток грамнегативних і грампозитивних мікроорганізмів. Найбільш активний в відношенні Staphylococcus spp., включаючи Staphylococcus aureus і Staphylococcus epidermidis (коагулаза-негативні і коагулаза-позитивні). Тести на бактеріальну чутливість показують, що в деяких випадках мікроорганізми, резистентні до гентаміцину, залишаються чутливими до тобраміцину.

Порівняно з іншими антибіотиками, дія тобраміцину більше виражена при інфекціях, викликаних Pseudomonas aeruginosa або Enterococcus faecalis. Але даний антибіотик не ефективний по відношенню до більшості штамів стрептококів групи D [13].

3.3 Застосування тобраміцину

Тобраміцин застосовується для внутрішньом’язового і внутрішньовенного застосування при інфекційних захворюваннях, викликаних чутливою мікрофлорою, а саме − інфекціях жовчовивідних шляхів, кісток і суглобів (остеомієліт), ЦНС (в т. ч. менінгіт), інфекціях черевної порожнини (у т. ч. перитоніт), органів дихання (в т.ч. пневмонія, емпієма плеври, абсцес легенів), інфекціях шкіри і м'яких тканин (у т. ч. інфіковані опіки), сечовивідних шляхів (у т. ч. пієлонефрит, пієліт, цистит ), сепсис, післяопераційні інфекції [7].

Також можливе застосування тобраміцину для інгаляційного застосування. В данному випадку антибіотик використовується проти інфекцій дихальних шляхів, викликаних Pseudomonas aeruginosa (синьогнійною паличкою) у пацієнтів з муковісцидозом у віці від 6 років і старше.

В офтальмології можливе застосування тобраміцину проти бактеріальних інфекцій ока та його придатків. Дані інфекції можуть бути спричинені чутливою мікрофлорою, в т. ч. блефарит, кон'юнктивіт, кератокон'юнктивіт, блефарокон'юнктивіт, кератит, іридоцикліт [13].

РОЗДІЛ 4. Обґрунтування вибору технологічної схеми

.1 Обґрунтування вибору біологічного агента

Різноманітні антибіотики синтезуються великою кількістю мікроорганізмів. Близько 80 % відомих антибіотиків синтезуються актиноміцетами, до того ж які відносяться до одного роду цього порядку - Streptomyces. Дуже рідко утворюють антибіотики представники еубактерій, виняток становлять лише деякі спорогенні бацили, які продукують поліпептидні антибіотики певного класу. Антибіотики синтезуються багатьма грибами, але їх структура менш різноманітна, ніж структура антибіотиків, які продукуються актиноміцетами [2].

Здатність до синтезу антибіотиків не є строго видоспецифічною ознакою. Один і той же антибіотик може продукуватися організмами, що відносяться до різних видів, родів і навіть порядків. І навпаки: штами одного виду можуть синтезувати різні антибіотики. Проте, чим далі стоять один від одного мікроорганізми в таксономічному ряді, тим менша ймовірність, що вони утворюють один і той же антибіотик [5].tenebrarius − в промисловому відношенні важливий мікроорганізм, що продукує комплекс антибіотиків, які, головним чином, складаються із аміноглікозидів. Аміноглікозидні антибіотики - це великий клас препаратів, що утворюється мікроорганізмами родів Streptomyces, Micromonospora і Bacillus. Характерною особливістю їх будови є наявність в молекулі циклічного аміноспирту. Аміноглікозидні антибіотики, взаємодіючи з рибосомами, необоротно пригнічують синтез білка і, таким чином, володіють бактерицидною дією [15].. tenebrarius продукує аміноглікозидний комплекс антибіотика небраміцину, який складається з тобраміцину, канаміцину та апраміцину. Тобраміцин і канаміцин можуть бути гідролізовані в активні форми. Якщо S. tenebrarius використовується для вироблення тобраміцину, синтез інших компонентів небраміцину зменшує вихід тобраміцину і спричиняє проблеми в його обробці. Зокрема, канаміцин важко відділити від тобраміцину через їх хімічну подібність [13].

Якщо S. tenebrarius використовується для промислового виробництва тобраміцину, то канаміцин є небажаним побічним продуктом. Ці два антибіотики відрізняються гідроксильною групою, яка наявна в канаміцину і зменшується у тобраміцину в результаті біосинтезу.. tenebrarius TD 507 - єдиний із актиноміцетів, який має метилазу 16S рРНК, що діє на сайти G1405 і А1408. Для нього характерна наявність трьох ферментів, які модифікують антиген (АГ). Таким чином, він немає собі рівних за широтою спектра стійкості до АГ [15].

Іншим продуцентом тобраміцину є штам Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini ВКПМ Ас-1083 і штам Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramicini var. nov. 2242 [8].

Відомий штам Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramicini var. nov. 2242. − продуцент аміноглікозидних антибіотиків небраміцінового комплексу. Недоліком даного штаму є низький рівень вмісту тобраміцину в культуральної рідини (не більше 1 г/л), оскільки в результаті біосинтезу в більшій кількості утворюється апраміцин [8].

Штам Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini ВКПМ Ас-1083 також є продуцентом тобраміцину, але здебільшого використовується як продуцент канаміцину, що утворюється в більшій кількості, ніж тобраміцин [8].

Для визначення продуктивної здатності Streptoalloteichus cremeus subsp. tobramycini ВКПМ Ас-1083 було проведено дослід з виділенням тобраміцину з культуральної рідини з використанням колонкової хроматографії на карбоксильних катіонітах при ступінчастій елюції розчинами аміаку, гідролізом при 100 °С в (0,1−0,3) Н. розчині їдкого натру, з повторним хроматографічним очищенням, концентрацією у вакуумі, при підкисленні розчином сірчаної кислоти до pH 4,5 і осадженням метанолом у формі сульфату. Результати показав, що даний штам здатний продукувати тобраміцин в кількості − 1,5 г/л [8].

Найважливішим продуцентом тобраміцину який володіє підвищеною продуктивною здатністю до синтезу даного антибіотика, є S. tenebrarius TD 507. Даний штам було отримано зі штаму S. tenebrarius ATCC 17920 дією на нього ультрафіолетового випромінення. Також, штам S. tenebrarius TD 507 можна отримати дією N-метил-N-нітро-нітрозогуанідину. Даний штам здатний синтезувати 1,75 − 2 г/л даного антибіотика [15].

Для промислового виробництва антибіотиків необхідним є наявність штаму, який володіє підвищеною синтетичною активністю, крім того продуцент повинен утворювати максимум продукту при рості на дешевій сировині при її мінімальному використанні. Для одержання антибіотика тобраміцину таким пробуцентом є штам S. tenebrarius TD 507, який, порівняно з іншими відомими продуцентами, утворює значну кількість антибіотика (1,7 - 2 г/л).

4.2 Обґрунтування вибору складу поживного середовища

Для росту і розвитку продуцента в поживних середовищах необхідна наявність в потрібній кількості і в засвоюваній формі поживних речовин. Для культивування можуть бути використані поживні середовища такого складу:

Середовище № 1 г/л [15]:

Глюкоза - 8;

(NH4)2SO4 - 2;- 2;

КН2РО4 - 0,08;×7H2O - 0,5; ×7H2O - 10 мг/л;×7H2O - 10 мг/л;×H2O - 0,2 мг/л;×5H2O - 0,02 мг/л;×6H2O - 0,02 мг/л;

Також як джерело вуглецю може використовуватися суміш глюкози (4 г/л) і гліцерину (4 г/л). Проте в даному випадку в 3 рази збільшується утворення канаміцину, який входе до складу комплексу синтезованих антибіотиків, і, відповідно, зменшується кількість тобраміцину [15].

Поживне середовище доводять демінералізованою водою до кінцевого об’му, pH = 6,8, температура підтримується на рівні 37 °С протягом всього процесу культивування [15].

Середовище № 2 г/л [14]:

Гліцерин − 2;

Кукурудзяний екстракт - 2;

Тваринний жир - 0,75;Cl - 0,2;- 0,3;

Крейда - 0,5;

Поживне середовище доводять водопровідною водою до кінцевого об’му, pH = 6,8 - 7,0, температура підтримується на рівні 35 - 37 °С. Процес культивування триває 72 - 120 год.

Проте дослідження показали що при культивування S.tenebrarius на поживному середовищі даного складу, кількість тобраміцину значно зменшується, оскільки відбувається збільшення синтезу апраміцину, який входить у комплекс синтезованих антибіотиків [14].

Даний біологічний агент не потребує факторів росту, проте на комплексних середовищах з природними субстратами, де зазвичай присутні ці речовини, росте швидше і активніше синтезує білки [15].

Отже, оскільки S.tenebrarius є продуцентом комплексу аміноглікозидних антибіотиків (тобраміцин, апраміцин, канаміцин), то для одержання надсинтезу тобраміцину, необхідно підібрати необхідні умови культивування та поживне середовище складу № 1 ,в якому джерелом вуглецю є глюкоза.

4.3 Обрахунок складу поживного середовища

Скласти базове поживне середовище для вирощування штаму Streptomyces tenebrarius TD 507 - продуцента тобраміцину, якщо за 72 години культивування концентрація тобраміцину в культуральній рідині становить 1,75 г/л, а концентрація біомаси 2,5 г/л.

Розрахунок вмісту в середовищі джерела вуглецевого живлення

Потреби для синтезу тобраміцину. Як джерело вуглецю для одержання тобраміцину використовують глюкозу. Розрахуємо вміст глюкози у середовищі, необхідний для одержання 1,75 г/л тобраміцину.

Молекулярна маса тобраміцину становить 467. У 467 г тобраміцину міститься 216 г вуглецю, тоді у 1,75 г тобраміцину вміст вуглецю становить (1,75 × 216) / 467 = 0,8 г.

Далі розрахуємо, в якій кількості глюкози міститься ця кількість вуглецю. У 180 г глюкози міститься 72 г вуглецю, тоді 0,8 г вуглецю буде міститися в (180 × 0,8) / 72 = 2 г глюкози. Враховуючи, що при вирощуванні мікроорганізмів на глюкозі, близько 40 % субстрату окислюється до СО2 для одержання енергії, необхідної для конструктивного метаболізму, вміст глюкози в середовищі становитиме (2 × 0,4) + 2 = 2,8 г/л.

Потреби для синтезу біомаси. Припустимо, що у біомасі міститься 50 % вуглецю. Таким чином, у 2,5 г біомаси вміст вуглецю становить 1,25 г.

Розрахуємо кількість глюкози, необхідного для одержання 2,5 г/л біомаси. Молекулярна маса глюкози становить 180. Отже, у 180 г глюкози міститься 72 г вуглецю, тоді 1,25 г вуглецю буде міститися в (180 × 1,25) / 72 = 3,75 г глюкози. Враховуючи 40 % втрат субстрату на «холосте окиснення», для одержання 2,5 г/л біомаси, необхідно внести (3,75 × 0,4) + 3,75 = 5,25 г/л

Отже, загальний вміст глюкози в середовищі, необхідний для синтезу біомаси (2,5 г/л) і тобраміцину (1,75 г/л), становить 2,8 + 5,25 = 8,05 г/л.

Розрахунок вмісту в середовищі джерела азотного живлення

Потреби для синтезу біомаси. Припустимо, що в біомасі міститься 10 % азоту. Таким чином, у 2,5 г біомаси вміст азоту становить 0,25 г.

Для отримання тобраміцину в промислових умовах використовують середовище, яке містить як джерело мінерального азоту сульфат амонію (NH4)2SO4.

Розрахуємо кількість сульфату амонію, необхідного для одержання 2,5 г/л біомаси. Молекулярна маса (NH4)2SO4 становить 132. Отже, у 132 г сульфату амонію міститься 28 г азоту, тоді 0,25 г азоту буде міститися у (132 × 0,25) / 28 = 1,18 г солі.

Для одержання 2,5 г/л біомаси вміст (NH4)2SO4 у середовищі культивування повинен становити 1,18 г/л.

Потреби для синтезу тобраміцину. Азот входить до складу не тільки біомаси, але й тобраміцину. Розрахуємо вміст (NH4)2SO4 у середовищі, необхідний для одержання 1,75 г/л тобраміцину.

Молекулярна маса тобраміцину становить 467. У 467 г тобраміцину міститься 70 г азоту, тоді у 1,75 г тобраміцину вміст азоту становить (1,75 × 70) / 467 = 0,26 г.

Далі розрахуємо, в якій кількості сульфату амонію міститься ця кількість азоту. У 132 г сульфату амонію міститься 28 г, тоді 0,26 г азоту буде міститися в (132 × 0,26) / 28 = 1,2 г солі.

Тому, для одержання 1,75 г/л тобраміцину вміст сульфату амонію в середовищі буде становити 1,2 г/л.

Отже, загальний вміст сульфату амонію в середовищі, необхідний для синтезу біомаси (2,5 г/л) і тобраміцину (1,75 г/л), становить 1,18 + 1,2 = 2,28 г/л.

Розрахунок вмісту джерела фосфору в середовищі

У біомасі міститься близько 3 % фосфору. Отже, для синтезу 2,5 г/л біомаси вміст фосфору у середовищі повинен становити 2,5 × 0,03 = 0,075 г/л. Джерелом фосфору у промисловому виробництві тобраміцину є дигідрофосфат калію КН2РО4.