Курсовая работа (т): Процес біосинтезу аміноглікозидного антибіотика тобраміцину

ДР1.5.3. Перевірка на герметичність

Перевірку обладнання на герметичність проводять після проведення всіх ремонтних та перевірочних робіт. Ємкісне обладнання на герметичність перевіряють при повітряному тиску 0,5-0,6 МПа. Якщо упродовж 30 хв тиск (за манометром) не знижується, обладнання вважають герметичним. Фланцеві з’єднання та зварні шви перевіряють на герметичність за допомогою мильної води при повітряному тиску від 0,5 до 0,6 МПа.

Герметичність парових вентилів перевіряють на дотик. Обов’язково раз на тиждень на герметичність перевіряють посівну лінію з усуненням усіх можливих пропусків. Під паровим тиском перевіряють всі матеріальні, посівні і конденсатні вентилі та трубопроводи.

ДР1.5.4.Стерилізація.

Після перевірки обладнання та комунікацій на герметичність, подають гостру пару Т=125-130°С, Р=0,2МПа.

По закінченні стерилізації зупиняють подачу гострої пари, ставлять всі вузли під паровий захист та знижують тиск. При зниженні тиску проводять охолодження до температури 90 ºС.

ДР-2 Підготовка стерильного повітря

ДР-2.1. Забір атмосферного повітря

Атмосферне повітря забирають через забірну шахту на висоті 30 м.

ДР-2.2. Очищення на фільтрі грубої очистки

Попередню очистку повітря здійснюють у чарунковому фільтрі. При проходженні повітря через фільтр грубого очищення, пил та механічні частки з повітря осідають, а очищене повітря надходить у компресор. Ступінь очищення становить Е = 80 %.

ДР-2.3. Стабілізація термодинамічних показників повітря

При стисканні повітря у компресорі його температура підвищується з 15-25 ºС на вході в повітродувку до 90 ºС на виході з неї. Перед подачею в головний фільтр повітря охолоджують.

Після компресора повітря має наступні характеристики : Р = 0,35-0,5 МПа, t = 60 0С, W = 60 %.

ДР-2.4. Очищення повітря в фільтрі тонкої очистки

Попереднє очищення повітря від пилу та мікроорганізмів здійснюється в головному фільтрі. Головний фільтр представляє собою циліндричну ємність з сферичним дном та кришкою. В середині фільтру знаходяться дві решітки, між якими розміщають фільтруючий матеріал. Заміна фільтрувального матеріалу проводять 2 рази на рік. У разі забруднення, зволоження, інфікування фільтруючого матеріалу проводять позачергову його заміну.

Охолоджене повітря, проходячи крізь шар базальтового волокна, очищається від пилу та мікроорганізмів. Ступінь очищення становить Е = 99,5%.

Заключна стадія очищення повітря від контамінантів здійснюється в індивідуальному фільтрі.

Як фільтруючий матеріал використовують фторопластові втулки, товщиною 4 мм. Фільтр являє собою металевий циліндр з кришкою та конічним дном. Ступінь очищення становить Е = 99,99%.

ДР-3. Підготовка допоміжних речовин

ДР-3.1. Приготування розчину соляної кислоти

Для запобігання випаданню фосфорних солей в осад, при їх сумісній стерилізації із солями Mg i Ca, використовується 6 % розчин HCl.

ДР-3.2. Приготування розчину гідроксиду натрію

% розчин NaOH готується для подальшої стабілізації рН середовища.

ДР-3.2.1. Стерилізація розчину гідроксиду натрію

Стерилізацію здійснюють в автоклаві при температурі 131 °С протягом 40 хв.

ДР-4. Приготування компонентів поживного середовища

Перед приготуванням середовища усі компоненти стерилізуються. Режим стерилізації залежить від природи речовини.

ДР-4.1. Приготування компонентів поживного середовища для качалочних колб

Враховуючи склад поживного середовища, потрібно обрахувати кількість всіх компонентів для приготування 1,4 л.

Склад поживного середовища г/л:

Глюкоза - 8;              розчин 1

(NH4)2SO4 - 2;       розчин 2

КН2РО4 - 0,08;×7H2O - 0,5; розчин 3- 2; ×7H2O - 10 мг/л;×7H2O - 10 мг/л;×H2O - 0,2 мг/л;                  розчин 4×5H2O - 0,02 мг/л;×6H2O - 0,02 мг/л;

ДР-4.1.1. Приготування і стерилізація розчину 1

Приготування розчину 1:

Глюкоза: 2 г - 1000л

х г - 1400мл; х = 11,2 г.

Готуємо 40 % розчин глюкози: 0,4 = 11,2 г/ х мл; х = 28 мл ≈ 30 мл.

Таким чином, 11,2 г глюкози розчиняємо в 30 мл дистильованої води. Стерилізуємо розчин в автоклаві при таких параметрах: Т = 112 °С, р = 0,5 атм, t = 30 хв.

ДР-4.1.2. Приготування і стерилізація розчину 2

Приготування розчину 2.

(NH4)2SO4: 2 г - 1000 мл

х г - 1400 мл; х = 2,8 г.

КН2РО4: 0,08 г - 1000 мл

х г - 1400 мл; х = 0,112 г

Розчин 2 готуємо в 600 мл дистильованої води. Стерилізацію проводимо при температурі 131 °С, р = 1,5 атм, протягом 40 хв.

ДР-4.1.3. Приготування і стерилізація розчину 3

Приготування розчину 3:×7H2O:    0,5 г - 1000 мл

х г - 1400 мл; х = 0,7 г: 2 г - 1000 мл

х - 1400 мл; х = 2,8 г.

Наважки солей зважуємо і розчиняємо в 750 мл водопровідної води. Стерилізацію розчину солей проводимо в автоклаві при таких параметрах: Т = 131 °С, р = 1,5 атм, t = 40 хв.

ДР-4.1.4. Приготування і стерилізація розчину 4

Приготування розчину 4:

Розчин 4 у своєму складі містить мікроелементи. На 100 мл поживного середовища вноситься приблизно 1 мл мікроелементів. Тобто, на 1400 мл поживного середовища потрібно внести близько 14 мл розчину 4. Для приготування потрібно: ×7H2O: 10мг - 1000 мл

х мг - 1400 мл; х = 14 мг.×7H2O: 10мг - 1000 мл

х мг - 1400 мл; х = 14 мг.×H2O: 0,2 мг - 1000 мл

х мг - 1400 мл; х = 0,28 мг.×5H2O: 0,02 мг - 1000 мл

х мг - 1400 мл; х = 0,028 мг.×6H2O: 0,02 мг - 1000 мл

х мг - 1400 мл; х = 0,028 мг.

Розчин готуємо у 20 мл дистильваної води. Стерилізацію розчину 4 проводимо в автоклаві при таких параметрах: Т = 131 °С, р = 1,5 атм, t = 40 хв .

ДР-4.2. Приготування компонентів поживного середовища для ферментера об’ємом 30 л.

Наступним етапом є приготування 14 л посівного матеріалу, для цього необхідно приготувати поживного середовища:

л - 1,4 л = 12,6 л, де 1,4 л - кількість посівного матеріалу із попереднього етапу.

Для приготування такої кількості поживного середовища потрібно:

Розчин 1: 1,4 л - 30 мл

,6 л - х; х = 270 мл;

Розчин 2: 1,4 л - 600 мл

,6 л - х ; х = 5400 мл = 5,4 л;

Розчин 3: 1,4 л - 750 мл

,6 л - х ; х = 6750 мл = 6,75 л;

Розчин 4: 1,4 л - 20 мл

,6 л - х; х = 180 мл;

ДР-4.2.1. Приготування і стерилізація розчину 1

Для приготування розчину 1 потрібна така кількість глюкози, аби отримати 40 % розчин: 30 мл - 11,2 г

мл - х; х = 100,8 г;

Тому, 100,8 г глюкози розчиняємо у 270 мл дистильованої води. Розчин стерилізуємо при Т = 112 °С, р = 0,5 атм, t = 30 хв.

ДР-4.2.2. Приготування і стерилізація розчину 2

Для приготування розчину 2, потрібно:

(NH4)2SO4: 1 л - 2 г

,6 л - х; х = 25,2 г.

КН2РО4: 1 л - 0,08 г

,6 л - х; х = 1 г;

Солі розчиняємо у дистильованій воді і стерилізуємо в автоклаві при таких умовах: Т = 131 °С, р = 1,5 атм, t = 40 хв.

ДР-4.2.3. Приготування і стерилізація розчину 3

Для приготування розчину 3 потрібно:×7H2O:         1 л - 0,5 г

,6 л - х; х = 6,3 г;: 1 л - 2 г

,6 л - х; х = 25,2 г;

Розчин готуємо на водопровідній воді. Стерилізацію проводимо в автоклаві: Т = 131 °С, р = 1,5 атм, t = 40 хв.

ДР-4.2.4. Приготування і стерилізація розчину 4

Для приготування розчину 4 потрібно: ×7H2O: 1 л - 10 мг

,6 л - х; х = 126 мг;×7H2O: 1 л - 10 мг

,6 л - х; х = 126 мг;×H2O: 1 л - 0,2 мг

,6 л - х; х = 2,52 мг;×5H2O: 1 л - 0,02 мг

,6 л - х; х = 0,252 мг;×6H2O 1 л - 0,02 мг

,6 л - х; х = 0,252 мг;

Стерилізацію розчину 4 проводимо в автоклаві при таких параметрах: Т = 131 °С, р = 1,5 атм, t = 40 хв.

ДР-4.3. Приготування компонентів поживного середовища для ферментера об’ємом 250 л

Далі потрібно приготувати 140 л посівного матеріалу, для цього потрібно поживного середовища: 140 л - 14 л = 126 л, де 14 л - кількість посівного матеріалу із попереднього етапу.

ДР-4.3.1. Приготування і стерилізація розчину глюкози

Розчин глюкози: 12,6 л - 270 мл

л - х; х = 2,7 л ≈ 3 л;

г глюкози розчиняємо у 3 л дистильованої води. Стерилізацію проводимо у автоклаві при Т = 112 °С, р = 0,5 атм, t = 30 хв.

ДР-4.3.2. Приготування і стерилізація солей поживного середовища

Для приготування 126 л поживного середовища, потрібна така кількість солей:

(NH4)2SO4 − 252 г;

КН2РО4 − 10 г;×7H2O - 63 г;− 252 г; ×7H2O - 1,26 г;×7H2O − 1,26 г;×H2O − 25,2 мг;×5H2O - 2,5 мг;×6H2O - 2,5 мг;

Наважки солей завантажуються у ферментер місткістю 250л і заливаються 123 л водопровідної води. Для запобігання випадання фосфорних солей в осад, рН середовища доводиться до значення 4,5 - 5 за допомогою 6 % HCl. Параметри стерилізації такі: Т = 131 °С, р = 1,5 атм, t = 40 хв . Після стерилізації розчин охолоджується і його рН доводиться до значення 7,0 за допомогою стерильного 10 % розчину NaOH.

ДР-4.4. Приготування компонентів поживного середовища для ферментера об’ємом 2000 л

Далі потрібно приготувати 1400 л посівного матеріалу. Для цього потрібно поживного середовища: 1400 л - 140 л = 1260 л.

ДР-4.4.1. Приготування і стерилізація розчину глюкози

Для приготування такої кількості поживного середовища потрібна така кількість глюкози:

л - 2,7 л

л - х; х = 27 л;

кг глюкози розчиняємо у 27 л дистильованої води. Стерилізацію проводимо при Т = 112 °С, р = 0,5 атм, t = 30 хв. у окремому збірнику об’ємом 50 л, який має рубашку, для регулювання температури.

ДР-4.4.2. Приготування і стерилізація солей поживного середовища

Для приготування 1260 л поживного середовища, потрібна така кількість солей:

(NH4)2SO4 − 2,5 кг;

КН2РО4 − 100 г;

MgSO4×7H2O - 630 г;− 2,5 кг.

ZnSO4 ×7H2O - 12,6 г;×7H2O − 12,6 г;×H2O − 252 мг;×5H2O - 25 мг;×6H2O - 25 мг;

Наважки солей завантажуються у ферментер місткістю 2000 л і заливаються 1233 л водопровідної води. Для запобігання випадання фосфорних солей в осад, рН середовища доводиться до значення 4,5 - 5 за допомогою 6 % HCl. Параметри стерилізації такі: Т = 131 °С, р = 1,5 атм, t = 40 хв . Після стерилізації розчин охолоджується і його рН доводиться до значення 7,0 за допомогою стерильного 10 % розчину NaOH.

ДР-4.5. Приготування компонентів поживного середовища для ферментера об’ємом 20000 л

Для процесу біосинтезу потрібна така кількість поживного середовища: 14000 л - 1400 л = 12600 л.

ДР-4.5.1. Приготування і стерилізація розчину глюкози

Потрібно приготувати глюкози:

л - 27 л

л - х; х = 270 л;

кг глюкози розчиняємо у 270 л дистильованої води. Стерилізацію проводимо при Т = 112 °С, р = 0,5 атм, t = 30 хв. у окремому збірнику об’ємом 500 л , який має рубашку, для регулювання температури.

ДР-4.5.2. Приготування і стерилізація солей поживного середовища

Для приготування 12600 л поживного середовища, потрібна така кількість солей:

(NH4)2SO4 − 25 кг;

КН2РО4 − 1 кг;

MgSO4×7H2O - 6,3 кг;− 25 кг;

ZnSO4 ×7H2O - 126 г;×7H2O − 126 г;×H2O − 2,52 г;×5H2O - 250 мг;×6H2O - 250 мг;

Наважки солей завантажуються у ферментер місткістю 20000 л і заливаються 1233 л водопровідної води. Для запобігання випадання фосфорних солей в осад, рН середовища доводиться до значення 4,5 - 5 за допомогою 6 % HCl. Параметри стерилізації такі: Т = 131 °С, р = 1,5 атм, t = 40 хв . Після стерилізації розчин охолоджується і його рН доводиться до значення 7,0 за допомогою стерильного 10 % розчину NaOH.

ДР-5. Підготовка і стерилізація піногасника

ДР-5.1. Приготування піногасника

В якості піногасника використовується полімер плюронік. Завантажується необхідна кількість для стерилізації.

ДР-5.2. Стерилізація піногасника

Стерилізацію проводять при 120 ºС протягом 30 хвилин, Р = 0,075 МПа.

ТП-6. Підготовка посівного матеріалу

Для засівання готують посівний матеріал глибинним способом.

ТП-6.1. Приготування 1,4 л інокуляту Streptomyces tenebrarius

В колбу місткістю 2 л зливаємо стерильні розчини 1, 2, 3, 4 від ДР-4.1.1., ДР-4.1.2., ДР-4.1.3., ДР-4.1.4.. Розливаємо дане поживне середовище по 100 мл в попередньо простерилізовані качалочні колби місткістю 750 мл. В стерильних умовах в кожну качалочку колбу вносимо посівну культуру зі скошеного агаризованого середовища в пробірках (14 пробірок з культурою). Колби ставимо на качалки з частотою обертання 120 об/хв. При температурі 37 °С протягом 2 діб. Значення рН = 6,8.

ТП-6.2. Приготування 14 л інокуляту

Стерильні розчини 1, 2, 3, 4 від ДР-4.2.1., ДР-4.2.2., ДР-4.2.3., ДР-4.2.4. зливаємо у попередньо простерилізований ферментер місткістю 30 л в стерильних умовах (зливаємо у зливний бачок при палаючому факелі). Потім вносимо 1,4 л посівного матеріалу, приготовленого на попередньому етапі. Культивування проводиться протягом 2 діб при Т = 37 °С, рН = 6,8 при постійному перемішуванні і аерація.

ТП-6.3. Приготування 140 л інокуляту

Даний етап проводять у ферментері об’ємом 250 л. Після змішування всіх компонентів середовища, додається посівний матеріал зі стадії ТП 6.2. Приготування посівного проводиться при Т = 37 ºС, t = 48 год, рН = 6,8.

ТП-6.4. Приготування 1400 л інокуляту

Для приготування даної кількості посівного матеріалу, до простерилізованого розчину солей додається стерильний розчин глюкози, що стерилізувався в окремому збірнику, ферментер, об’єм якого 20000 л , далі дадається інокулят у кількості 140 л з попередньої стадії. Посівний готується при Т = 37 ºС, t = 48 год, рН = 6,8.

ТП-7. Виробниче культивування

ТП-7.1. Виробниче культивування

До загального об’єму стерильного розчину солей подаємо розчин глюкози і засіваємо середовище приготовленим на попередньому етапі інокулятом (1400 л).

Культивування проводиться протягом 5 діб при Т = 37 °С, рН = 6,8 при постійному перемішуванні і подачі очищеного повітря.

6.3 Контроль виробництва

Згідно науково-технічної документації на підприємстві забезпечується контроль процесу виробництва антибіотика та контроль готової продукції. Це здійснюється для забезпечення відповідності готової продукції вимогам.

Упродовж всього процесу виробництва продукту, неюхідно проводити контроль санітарного стану цехів та робочих місць, відповідність сировини, допоміжних матеріалів, та ін.

Таблиця 6.3.1.

Карта постадійного контролю