Курсовая работа (т): Процес біосинтезу аміноглікозидного антибіотика тобраміцину

Розрахуємо кількість КН2РО4, необхідного для одержання 2,5 г/л біомаси. Молекулярна маса КН2РО4 становить 136. Отже, у 136 г дигідрофосфат калію міститься 31 г фосфору, тоді 0,075 г фосфору буде міститися у (136 × 0,075) / 31 = 0,3 г солі.

Для одержання 2,5 г/л біомаси вміст КН2РО4 у середовищі культивування повинен становити 0,3 г/л.

Склад поживного середовища для культивування продуцента тобраміцину

Наведені вище розрахунки щодо складу поживного середовища можна подати у вигляді таблиці.

Таблиця 1.1.

4.4 Обґрунтування способу проведення біосинтезу

Вибір способу проведення біосинтезу відіграє важливу роль в процесі росту мікроорганізмів. Наявні різні види культивування: глибинне, поверхневе, періодичне, безперервне [4].

До промислових способів культивування мікроорганізмів належать періодичне, безперервне культивування та культивування іммобілізованих клітин.

Найбільш поширений спосіб періодичного культивування. При даному способі інокулят вносять у поживне середовище, яке містить задану кількість всіх необхідних поживних речовин. При цьому ні один з істотних компонентів поживного середовища не надходить у систему у процесі культивування, тобто це закрита система [4].

Періодичне культивування застосовується як для поверхневих культур (на поверхні твердого поживного середовища), так і глибинних культур (в рідкому поживному середовищі). Зростання мікроорганізмів у поживному середовищі припиняється тоді, коли зміст якого-небудь з необхідних компонентів середовища досягає мінімуму або у середовищі накопичуються продукти метаболізму, що інгібують ріст мікроорганізмів.

Існує також напівбезперервне культивування, коли частина обсягу з біореактора час від часу вилучається при додаванні еквівалентного обсягу середовища. Це призводить до регулярного омолодження культури і до затримки її переходу до фази відмирання. Такий режим культивування в значній мірі уподібнюється безперервному процесу, тому називається також напівбезперервним культивуванням [4].

У безперервних процесах біооб'єкти постійно підтримуються в експоненційній фазі росту. Забезпечується безперервний приплив свіжого поживного середовища в біореактор і відтік з нього культуральної рідини, що містить клітини та продукти їх життєдіяльності. Фундаментальним принципом безперервних процесів служить рівновага між приростом біомаси за рахунок поділу клітин і їх зменшенням у результаті розведення свіжим середовищем.

Глибинне культивування мікроорганізмів має ряд очевидних переваг перед поверхневим, оскільки дозволяє значно скоротити виробничі площі, виключити важку непродуктивну ручну працю, покращити гігієну праці, спрощує механізацію та автоматизацію виробництва, робить можливим перехід на безперервний спосіб культивування. При глибинному способі культивування раціональніше використовуються поживні речовини середовищ, що дають можливість значно скоротити відходи виробництва у вигляді нерозчинних осадів твердого поживного середовища, отримувати препарати з меншим вмістом домішок і більшою питомою активністю. Глибинне культивування проводять у вертикальних герметичних ємностях різного розміру, що називаються ферментаторами [4].

При поверхневому культивуванні механізація процесу вирощування можлива шляхом створення безперервно діючих установок. В цьому випадку мікроорганізми вирощують на поверхні щільного середовища або в тонкому шарі рідкого середовища, і кисень надходить до них безпосередньо з повітря.

При поверхневому культивуванні важливо збільшити площу зіткнення середовища з повітрям. Для цього середовища наливають тонким шаром у посуд з широким дном - чашки Петрі, колби Виноградського, матраци. У рідких середовищах аеробні мікроорганізми часто ростуть, утворюючи на поверхні плівку. Факультативні анаероби розвиваються не тільки на поверхні, але і в товщі рідкого середовища, викликаючи більш-менш рівномірне її помутніння. Поверхневе культивування мікроорганізмів застосовується як в лабораторних умовах, так і в промисловості.

Недолік поверхневого способу - необхідність встановлення безлічі кювет, роботу з якими важко механізувати [4].

Отже, враховуючи всі ці дані, культивування S. tenebtarius проводимо глибинним методом. Тому, що цей мікрорганізм росте на рідкому поживному середовищі, потребує постійної аерації, частого технологічного контролю, також за глибинного методу культивування економляться виробничі площі.

4.5 Обгрунтування вибору ферментаційного обладнання

Промислове виробництво біопрепаратів являє собою складний комплекс взаємопов'язаних фізичних, хімічних, біофізичних, біохімічних, фізико-хімічних процесів і передбачає використання великої кількості різнотипного обладнання, яке пов'язане між собою матеріальними, енергетичними потоками і утворюють технологічні лінії. Основним апаратурним елементом біотехнологічного процесу є біореактор - ферментер. Біореактори призначені для культивування мікроорганізмів, накопичення біомаси, синтезу цільового продукту. Вони виготовляються з високолігірованних марок сталі, іноді з титану. Внутрішня поверхня біореактора повинна бути відполірована [3].

Всі форми та види ферментаційних систем створюються, маючи за основну мету забезпечення однакових умов для всіх компонентів що містяться в реакторі.

Вимоги щодо конструкції біореактора:

.        Біореактор повинен бути сконструйований так, щоб виключити можливість попадання сторонніх мікроорганізмів, а також забезпечити збереження потрібної мікрофлори;

.        Об’єм культивуємої суміші повинен залишатися постійним;

.        Рівень розчинного кисню повинен підтримуватися вище критичних рівнів керування культури аеробних організмів;

.        Параметри зовнішнього середовища, такі як температура, рН та інші повинні постійно контролюватися;

.        Культура при вирощування має добре перемішуватися [3].

Типи ферментерів

. Апарати, які мають дифузор з турбіною

Установки цієї групи мають в центрі концентрично розташований дифузор з відкритою або закритою турбіною, що обертається. Вона може бути розміщена в різних місцях по висоті. Швейцарська фірма «Процес інженірінг» (фірма «Хемап») розробила універсальні мішалки з дифузорами [3]:

. лопатева мішалка - апарат без дифузору з відбійником;

. пропелерна мішалка дифузор з завуженням донизу, де і встановлений пропелер;

. розлихлююча мішалка для подрібнення міцелію − без дифузора з відбійником;

. емульгаційна мішалка − дифузор з отворами;

. циркуляційна мішалка − дифузор з теплообмінником та отворами;

. багатоступеневий реактор з великою кількістю двосторонніх колес − дифузор з отворами;

. багатоступеневий реактор з двосторонніми турбінами та циркуляційним пристроєм − два дифузора, внутрішній з отворами, зовнішній має теплообмінник.

У більшості випадків повітря подається під мішалку. Для збільшення контакту фаз газ-рідина під дифузором встановлюють кільцевий повітряний колектор. Апарати також можуть мати зовнішнє охолодження з установкою холодильника в циркуляційній лінії [3].

. Самовсмоктувальні апарати з дифузором

Самовсмоктувальна турбіна створює розрідження завдяки якому через полий вал з верхньої частини апарату та ззовні засмоктується повітря. Апарати даної системи знаходять застосування в установках невеликої потужності [3].

«Хемап», «Фогельбуш» [16].

Апарати з обертаючими аераторами

Згідно основного рівняння масопередачі газ-рідина: сумарна кількість переданої маси пропорційна загальній поверхні фазового контакту, яка в свою чергу обернено пропорційна діаметру пухирців. При обертанні барботера виникає додаткова сила, що збільшує силу відриву, яка виникає завдяки різниці відносних швидкостей поверхні барботера з отворами в рідині. Тобто зменшується поверхня пухирця і збільшується поверхня контакту фаз газ-рідина [3]. «Фогельбуш» [16].

. Ферментери з механічною мішалкою для стерильних процесів

Більшість продуктів мікробного синтезу отримують в герметичних ферментерах, які мають корпус та вал з мішалкою, барботер та відбійники, які працюють в умовах строгої стерильності.

Можливе як безперервне так і періодичне культивування. Для безперервного культивування апарати оснащуються приладами автоматичного безперервного аналізу та реєстрації параметрів, а також приладами автоматичного управління процесами культивування. Безперервне культивування може здійснюватися в хемостатному та турбідостатному режимі [3].«Хемап», «Біотек», «Джованола», та інші [16].

. Ферментери з циркуляційною системою аерації

Застосування ежекторів забезпечує розвинену поверхню фазового контакту повітря-рідина і тим самим сприятливі умови для росту мікроорганізмів. Ефективні для середовищ, яким властива мала здатність до утворення піни. Апарат складається з ферментеру та циркуляційного контуру, в який включені насос і один чи кілька ежекторів. На кінці нагнітального трубопроводу встановлено сопло. Рідина циркулює за допомогою насоса [3]. «Фогельбуш» [16].

. Апарати з введенням енергії керуючим газом (барботажні апарати)

Розвинену поверхню газ-рідина забезпечують керамічні аератори. Але в неї є головний недолік - дуже швидко забиваються пори. Розроблені апарати у вигляді резервуару з розташованими на його днищі повітророзподільними коробками прямокутного січення з перфорованими кришками та отворами 0,3 - 0,5 мм [3].

. Апарати з дифузором (газліфтні)

Найбільш широкого застосування набули апарати системи Лефрасуа-Марійє, які мають циліндричну форму з кільцевим щілинним аератором. Прилад для циркуляції рідини представляє собою систему труб, рівномірно розподілених по довжині окружності ємності. Повітророзподілячі встановлені під кожною трубкою. Газліфтні апарати слугують для отримання білку [3].

. Апарати з зовнішнім циркуляційним контуром

В цю групу включені апарати з зовнішнім циркуляційним контуром, окрім тих, в яких циркуляцію забезпечує насос. Їх можна розділити на дві груми:

апарати з циркуляцією, що забезпечується піноутворюючими властивостями ферментаційного середовища за схемою рідина-піна-рідина;

апарати з виносним аераційним приладом.

Апарати ефективні за умови досить високої циркуляції ферментаційної рідини [3].

. Колонні ферментери

Застосовані в хімічній промисловості колонні апарати застосовуються і в мікробіологічній промисловості. Це досить добрі масообмінні апарати, однак мають дуже складну внутрішню конструкцію, а середовище та мікроорганізми здатні утворювати плівки, що важко змиваються .Існує два основних напрямки розробки та застосування колон в мікробіології:

. організація багатоступеневого процесу за окремими тарілками;

. використання в якості апаратів повного перемішування [3].

Система перемішування є важливим класифікуючим принципом біореакторів різного типу.

За способом перемішування біореактори бувають [6]:

. Апарати з механічним перемішуванням

Ці реактори мають механічну мішалку з центральним валом та лопатями, число яких може бути рівне 6 , рідше 8. Лопаті можуть бути прямими чи вигнутими, часто їх розміщують в кілька ярусів, що забезпечує більш ефективне перемішування великих об’ємів рідини. В систему також входять перегородки − вузькі металічні пластинки, що закріпленні на внутрішній частині біореактора. Вони запобігають утворенню водоворотів та забезпечують віхровий рух рідини, що рівномірно розподіляються по всьому об’єму. Не можуть застосовуватися - при культивуванні міцеліальних грибів. В деяких ферментерах використовують полі-мішалки, в яких повітря потрапляє в середовище культивування через отвори у нижній частині валів [6].

. Апарати з пневматичним перемішуванням.

В такого виду реакторів мішалка відсутня і перемішування рідини здійснюється бульбашками газу. Однак, швидкість масообміну їх набагато нижчав ніж у біореакторів з мішалкою. Ці апарати ваблять простотою конструкції та малими енергозатрат ними показниками. Їх ще розділяють на еірліфтні та бульбашкового типу. Недолік - слабке перемішування [6].

. Апарати з циркуляційним перемішуванням.

Ці апарати мають насоси та ежектори, які створюють направлений тік рідини по замкнутому контуру. Ці ферментери часто оздоблюють «насадками», які забезпечують краще перемішування [6].

Механічне перемішування сумішей здійснюється лопатевими, пропелерними, турбінними та спеціальними мішалками. Класифікацію перемішуючих пристроїв для біогазових реакторів наведено на рис. 4.5.1 [6].

Турбінні мішалки оснащено лопатями, і вони мають чітко окреслений ротор. Залежно від способу кріплення лопатей і їх конфігурації в анаеробній біоконверсії зустрічаються різні типи турбінних мішалок. Найбільш простою та одночасно високоефективною є мішалка з прямими радіально розміщеними лопатями. Плоскі лопаті можуть бути нахилені під певним кутом відносно площини обертання мішалки для кращого перемішування субстрату. Пропелерні мішалки вважаються найбільш ефективними в тих випадках, коли необхідно створити значну циркуляцію субстрату в біогазовій установці при мінімальній витраті механічної енергії. Вони виконують цю задачу краще, ніж мішалки іншого типу, наприклад, турбінні. Пропелерні мішалки створюють осьову циркуляцію органічних відходів всередині реактора за рахунок насосного ефекту, тому вони легко піднімають тверді частинки з його дна [6].

Рис. 4.5.1. Класифікація перемішуючих пристроїв.

Лопатеві мішалки почали першими використовуватись в системах біоконверсії та в хімічній промисловості взагалі. На сьогодні вони використовуються у тих випадках, коли немає необхідності в інтенсивній радіально - осьовій циркуляції органічної суміші в біогазовій установці. Основною перевагою лопатевих мішалок є їх простота та низька вартість.

Якірні та рамні мішалки вирізняються виключно низьким числом обертів. Діаметр таких мішалок наближається до діаметра біогазового реактора, а зазор між лопаттю та стінкою реактора є незначним. Таким чином, у випадку застосування цих мішалок можна уникнути місцевого перегріву субстрату чи виникнення осаду на дні реактора [6].

Шнекові мішалки працюють за тим принципом, що і пропелерні, але при менших числах обертів. Вони застосовуються для перемішування сумішей значної в’язкості, зокрема для органічного субстрату всередині біогазової установки. В цьому випадку вони затрачають менше енергії, ніж пропелерні мішалки для створення однакової циркуляції субстрату в біореакторі. Використання дискових та скребкових мішалок в процесах біоконверсії є неефективним, тому майже не застосовується.

Отже, проаналізувавши всі види ферментерів, можна зробити висновок, що для культивування S. tenebrarius найефективнішим являється ферментер з механічним перемішуванням барботажного типу. Основною перевагою механічного перемішування є те, що можна легко змінювати технологічні умови та ефективно доставляти до зростаючих клітин повітря, що визначає характер розвитку мікроорганізмів і їх біосинтетичну активність. Для перемішування оберемо турбінну мішалку, оскільки турбінні мішалки забезпечують інтенсивне перемішування у всьому обсязі апарата. Потужність, споживана турбінними мішалками, що працюють в апаратах з відбивними перегородками, при турбулентному режимі перемішування практично не залежить від в'язкості середовища. Тому мішалки цього типу можуть застосовуватися для сумішей, в'язкість яких під час перемішування змінюється [6].