Курсовая работа (т): Процес біосинтезу аміноглікозидного антибіотика тобраміцину

Проведення культивування S. tenebrarius передбачає забезпечення інтенсивного перемішування та аерації середовища. В обраному ферментері достатній рівень масообміну досягається встановленням відкритих та закритих турбінних мішалок та повітря, яке подається через барботер. Застосування відкритої турбінної мішалки розташованої над барботером також забезпечує високий рівень диспергування повітря, сприяючи збільшенню поверхні контакту фаз та коефіцієнту масопередачі. Крім того, продуцент утворює міцелій, який досить важливим для біосинтезу антибіотика, використання турбінної мішалки дозволяє уникнути значного пошкодження міцелію.

Запропонований апарат має високі масообмінні характеристики по кисню, в ньому легко можна варіювати режими перемішування та масообміну, забезпечується рівномірний розподіл мікроорганізмів та компонентів поживного середовища. Для забезпечення стерильності передбачено використання торцевих ущільнень валу перемішуючого пристрою з паровим захистом. Так вдається практично повністю запобігти потраплянню атмосферного повітря в апарат, що є дуже важливим для забезпечення асептичних умов культивування. Для створення в ферментері умов «повного відображення», для запобігання утворення обертального контура, котрий різко знижує інтенсивність перемішування, в апараті встановлюють перегородки (відбійники).

РОЗДІЛ 5. Характеристика біологічного агента

.1 Таксономічний статус біологічного агента

Мікроорганізми роду Streptomyces є найпоширенішими в природі актиноміцетами. Вони відомі як продуценти багатьох біологічно активних речовин, а саме антибіотиків, ферментів, вітамінів, лектинів, імуномодуляторів тощо. Легко змінюючись і пристосовуючись до різних умов мешкання, маючи великий набір ферментів, вони є активними деструкторами органічних речовин, відіграють велику ролі, у кругообігу речовин у природі, накопиченні та збереженні родючості ґрунтів [11].

Проблема систематики та ідентифікації мікроорганізмів завжди була однією з найважливіших для мікробіологів. Проте, незважаючи на більш ніж сторічний період відкриття і вивчення актиноміцетів та накопичений великий фактичний матеріал, досі не вдалося розробити єдину природну класифікацію цих мікроорганізмів. Це пояснюється, з одного боку, ототожнюванням видів з так званими типовими штамами стрептоміцетів, з іншого - описом нових видів без урахування внутрішньовидової мінливості. Дослідження показали, що завдяки мінливості в межах виду зустрічаються численні різновиди, які в дійсності є природними або штучними мутантами із властивостями, тією чи іншою мірою відмінними від материнського штаму. Ігнорування цього факту, а також певні труднощі у встановленні внутрішньопопуляційних зв'язків призвели до того, що виявилося значно простіше описати "новий" вид, ніж якомога точніше визначити походження нового штаму. Це й спричинило своєрідний феномен роду Streptomyces − згідно з різними джерелами літератури, цей рід на сьогодні нараховує від однієї до трьох тисяч і більше видів стрептоміцетів, в основному продуцентів антибіотиків. Опис більшості з них базується лише на типовому штамові [14].

На сьогодні маємо такий таксономічний статус S. tenebrarius згідно з II виданням Керівництва Бергі (табл. 5.1.1.) [17].

Таблиця 5.1.1.

Таксономічне положення актиноміцета згідно з II виданням Керівництва Бергі з систематики бактерій

5.2 Морфолого-культуральні ознаки

антибіотик тобраміцин біологічний промисловий

Актиноміцети − прокаріотна група одноклітинних мікроорганізмів, що утворюють гіфи або формують розвинений міцелій. Не дивлячись на морфологічні відмінності, актиноміцети віднесені до бактерій, так як для них характерні відсутність ядерної мембрани, малий діаметр клітин, ідентична хімічна природа клітинних стінок, бактеріальний тип джгутиків у рухливих бактерій [1].

Форма. Утворюють добре розвинений міцелій. Гіфи мають багато нуклеоїдів.

Розміри. Діаметр гіфів коливається в межах 0,5 - 1,5 мкм. Довжина ниток досягає декількох міліметрів.

Розмноження. Міцелій може бути стабільним або розпадатися на паличкоподібні та кокоподібні елементи. Якщо міцелій зберігається, то утворюються спори, за допомогою яких відбувається розмноження. Спори можуть утворюватися по одній, парами або ланцюжком з різної кількості клітин на повітряних чи субстратних гіфах (спороносцях), рідше - в спорангіях. Спороносці відрізняються довжиною (короткі, довгі), формою (прямі, зігнуті, спіральні), кількістю завитків, діаметром спіралей, розміщенням (рис.2.1).

Рис.5.2.1. Форми спороносців:

а - пряма, б - звивиста, в - пучковидна, г - первинні спіралі, д - відкриті спіралі, е - закриті спіралі, ж - міцелій актиноміцета [1].

Характерні морфологічні ознаки S. tenebrarius виявляють, продивляючись його при малому збільшенні безпосередньо на щільному середовищі в чашках Петрі. При цьому можна знайти субстратний міцелій, що розвивається в товщі агаризованого середовища, і повітряний, що розростається над поверхнею.

Для фіксації і фарбування міцелію використовують метод Грама. Здатність мікроорганізмів зафарбовуватись по методу Грама є важливою таксономічною ознакою, за якою всі бактерії ділять на дві групи: грампозитивні і грам негативні. S. tenebrarius належить до грампозитивних бактерій.

На агаризованих середовищах S. tenebrarius утворює щільні, компактні колонії різної структури і внутрішньої будови - гладкі, оксамитові, бугруваті, складчасті, плоскі, зморшкуваті. Колонії міцно вростають в середовище за допомогою субстратного міцелію. Колонії і особливо їх зрілий повітряний міцелій можуть бути не зафарбовані або пігментовані (сині, фіолетові, рожеві, помаранчеві, жовті), іноді з характерним землистим запахом [1].

5.3 Фізіолого-біохімічні ознаки біологічного агента

.tenebrarius по відношенню до кисню облігатний аероб, характерний окислювальний тип метаболізму. Катаболізм глюкози, що міститься в поживному середовищі, здійснюється за гліколітичним шляхом. Ключовими ферментами в даному процесі є фосфофруктокіназа та піруваткіназа.

Росте на середовищі з концентрацією солей солей 5 % і може рости в діапазоні рН = 5,5 - 8,0, з оптимумом рН = 7,0. Типом живлення, характерний для даного актиноміцета − хемоорганотрофія [15].

При вивченні даних ознак досліджують: ферментативну активність (розрідження желатини, казеїну, наявність целюлози, каталази, інвертази, реакцію побуріння, відновлення нітратів), асиміляцію джерел живлення (цукри, спирти, органічні кислоти), ріст на синтетичних середовищах з нітратами як єдиним джерелом азоту, потреба амонійного азоту, характер продуктів метаболізму і утворення антибіотичних речовин.

Йому властива природна множинна стійкість до антибіотиків. У більшості випадків детермінанти стійкості актиноміцетів до власного антибіотика та гени його біосинтезу зчеплені та координовано регулюються. Ідентифікація та клонування генів резистентності до власного антибіотика є, зазвичай, першим кроком у дослідженні генів біосинтезу антибіотиків. Одним із головних чинників, що лімітують біосинтез цих речовин, є ступінь резистентності штаму як до власного токсичного продукту, так і до інших антибіотиків. Встановлення закономірностей генетичного контролю стійкості актиноміцетів до антибіотиків та його ролі у біосинтезі має важливе значення для глибшого розуміння механізмів цих явищ, а також для розробки методів конструювання і селекції промислових продуцентів антибіотиків [1].

Однією з особливостей S. tenebrarius є його висока спонтанна мінливість. Гени стійкості до антибіотиків стали зручною моделлю для вивчення механізмів нестабільності генома актиноміцетів. Їх дослідження допомагає краще зрозуміти закономірності організації генома актиноміцетів та його мінливості. Воно має також важливе практичне значення, оскільки найчастіше нестабільними є ознаки, за якими проводиться селекція актиноміцетів [1].

Найважливішим продуцентом тобраміцину який володіє підвищеною продуктивною здатністю до синтезу даного антибіотика, є S. tenebrarius TD 507. Даний штам було отримано зі штаму S. tenebrarius ATCC 17920 дією на нього ультрафіолетового випромінення. Також, штам S. tenebrarius TD 507 можна отримати дією N-метил-N-нітро-нітрозогуанідину. Даний штам здатний синтезувати 1,75 − 2 г/л даного антибіотика [15].

РОЗДІЛ 6. Опис технологічного процесу біосинтезу тобраміцину

.1 Підрахунок кількості стадій підготовки посівного матеріалу

Загальний об’єм ферментера, в якому здійснюється культивування продуцента антибіотика тобраміцину - Streptomyces tenebrarius, 20 м3 Коефіцієнт заповнення Кзап. = 0,7. Звідси слідує, що робочий об’єм ферментера:

роб. = Vзаг. × Кзап = 20 × 0,7 = 14 м3 = 14000 л.

Визначаємо кількість стадій підготовки посівного матеріалу, для приготування 14000 л культуральної рідини. Кількість посівного матеріалу становить близько 10 % від загального об’єму поживного середовища.

Для приготування 14000 л культуральної рідини, потрібно: 14000 × 0,1 = 1400 л посівного. Таку кількість посівного можна приготувати у ферментері об’ємом 2 м3.

Щоб приготувати 1400 л культуральної рідини, потрібно мати: 1400 × 0,1 = 140 л посівного матеріалу. Таку кількість посівного можна приготувати у ферментері об’ємом 250 л.

140 л культуральної рідини можна приготувати, засіявши поживне середовище 140 × 0,1 = 14 л посівного матеріалу (приготування здійснюють у ферментері об’ємом 30 л).

Щоб приготувати 14 л культуральної рідини, потрібно мати: 14 × 0,1 = 1,4 л посівного матеріалу. Таку кількість посівного можна приготувати на качалочних колбах.

Тобто, процес підготування поживного середовища проходитиме в 4 етапи, п’ятим етапом буде сам процес біосинтезу.

6.2 Опис технологічного процесу

ДР-1.1. Підготовка персоналу до роботи

Персонал одягнений в технологічний одяг. Переміщення і ходіння персоналу обмежене. У виробничих приміщеннях забороняється прийом їжі.

Не рідше 1 разу на квартал персонал проходить технологічний інструктаж за вимогами, які висуваються до нього при роботі на даному виробництві з відповідним записом у журналі.

Особисті речі (пальто, плащі, головні убори, вуличне взуття) обслуговуючий персонал знімає в гардеробній, одягає перехідний одяг (халат, тапочки) й прямує до умивальної.

В умивальнії кімнаті миють руки під краном теплою водою до двох хвилин, використовуючи мило туалетне або дитяче, при необхідності використовують щітки для обробки білянігтевого простору. Для видалення мила руки ополоскують теплою водою і висушують електрорушником або стерильною серветкою і обробляють 76% етиловим спиртом.

Після обробки рук персонал одягає технологічний одяг.

ДР-1.2. Підготовка технологічного одягу

Перед пранням використаного одягу, необхідно провести його ретельний огляд. Це проводиться для того щоб запобігти нещасним випадкам.

Прання одягу проводиться після його огляду. Умови прання такі: температура 90 °С протягом 30 хв.

ДР-1.3. Підготовка миючих та дезінфікуючих розчинів

ДР-1.3.1. Підготовка перекису водню

Для обробки приміщень, повітроводів, обладнання використовують 0,5-6% розчин перекису водню з додаванням 0,5% миючого засобу.

ДР-1.3.2. Приготування хлораміну Б

Для знезараження підлоги застосовують також 1 або 2% розчин хлораміну Б. Для приготування 1 л робочого розчину хлораміну Б наливають відповідно 990 або 980 мл очищеної теплої води і розчиняють в ній відповідно 10 або 20 г хлораміну Б. Розчин готують для разового застосування.

ДР-1.3.3. Приготування розчину каустичної соди

Для миття та дезінфекції обладнання використовується 2% розчин каустичної соди. Для прикотування 1 л розчину беруть приблизно 20г сухої каустичної соди і додають близько 980мл води. Приготований розчин зберігають у герметично закритому скляному посуді в прохолодному місці.

ДР-1.4. Підготовка виробничих приміщень

ДР-1.4.1. Щоденне прибирання

Щодня проводять прибирання підлоги із застосуванням 3% розчину водню перекису і 0,5% миючого засобу з розрахунку 150-170 мл розчину на 1 м2. Для знезараження підлоги, поряд з розчином перекису водню і миючого засобу, використовують 1 або 2% розчин хлораміну Б.

Панелі, стіни, двері виробничих приміщень щодня протирають вологою хлопчасто-паперовою тканиною, змоченою в 3% розчині перекису водню з 0,5% миючого засобу. Особливо ретельно протирати ручки і нижні частини дверей.

Внутрішню скляну поверхню рам промивають і протирають у міру забруднення.

Для знезараження поверхні стін, підлоги, стелі, обладнання, а також повітря мікробіологічної лабораторії використовують бактерицидні лампи. Після проведення дезинфікуючою обробки приміщення звільняють від персоналу і включають настельні бактерицидні лампи не менше ніж на 2 години. Вимикачі для відкритих бактерицидних ламп розміщені поза опромінюваним приміщенням з сигнальним написом "Увімкнені бактерицидні лампи". Через кожні 2-3 години роботи ламп їх вимикають на 1,0-1,5 години. Встановлена потужність відкритих ламп не перевищує 2,0-2,5 Вт потужності на 1 м3 приміщення.

ДР-1.4.2. Генеральне прибирання

Генеральне прибирання виробничих приміщень проводять не рідше 1 разу на тиждень. Прибирають підлоги, стіни, стелі, повітроводи, підвіконня, поверхні всього обладнання, комунікації, всі виробничі меблі. В якості дезінфікуючих розчинів використовують 5% розчин водню перекису з додавання 0,5% миючого засобу, 1 або 2% розчин хлораміну Б (для обробки підлоги), нагрітий до температури 40-50 ° С.

Допоміжні приміщення (відділення водопідготовки і підготовки повітря, побутові приміщення) піддають обробці аналогічно виробничим приміщенням з періодичністю не рідше 1 разу на місяць.

Проводять обробку приміщень у гумових рукавичках, окулярах, респіраторі, гумових чоботях і фартуху.

Мікробіологічний контроль проводить мікробіолог за допомогою змивів стерильними тампонами не рідше 1 разу на тиждень під час виробничого процесу і за 1,5 год до початку роботи.

У змивах з 100 см2 поверхні допускається не більше 10 колоній неспороутворюючих мікроорганізмів на 2-х чашках Петрі.

У разі виявлення в повітрі і змивах приміщень грибів або спороутворюючої мікрофлори концентрацію водню перекису слід збільшити до 5%. Також необхідно чергувати дезінфікуючі засоби з метою уникнення утворення стійких форм мікроорганізмів.

ДР-1.5. Підготовка обладнання та комунікацій

ДР1.5.1. Зняття з’ємних частин обладнання та їх миття

З'ємні частини (вузли) обладнання, що безпосередньо стикаються з лікарськими речовинами або засобами, слід зняти, розібрати і ретельно вимити в розчині миючого засобу.

ДР1.5.2.Миття і дезінфікування обладнання

Через технологічне обладнання та комунікації пропускають миючий засіб. З'ємні частини (вузли) обладнання вимиваються в розчині миючого засобу при температурі 70-80 °С.

Один раз на місяць проводять обробку ферментеру 2% розчином каустичної соди. Для цього в ферментер по завантажувальній лінії з відділення приготування поживного середовища подають розчин каустичної соди за температури 20 °С, після чого ферментер заповнюють водою до необхідного рівня. Розчин каустичної соди в ферментері перемішують за допомогою мішалки чи подачею повітря через барботер упродовж 15 хв. Після дезинфекції обладнання ретельно промивають питною водою. В усіх цехах виробництва повинні бути розроблені графіки періодичного очищення та миття всього технологічного обладнання.