который образуется благодаря химической реакции между аминокислотными остатками серина, тирозина и глицина (аминокислоты
65 – 67).
Флуоресцентные наночастицы и нанокластеры. Другая группа флуоресцентных соединений – полупроводниковые нанокристаллы, или квантовые точки. При уменьшении физических размеров частиц полупроводника до нанометровых они начинают проявлять свойства, отличные от объемных полупроводников. В частности, речь идет о квантовых эффектах. При взаимодействии квантовой точки с электромагнитным излучением образуется экситон, который заперт в потенциальной яме. Рекомбинация экситона приводит к высвобождению энергии. Благодаря этому частицы нанометровых размеров, образованные из таких полупроводниковых веществ, как селенид кадмия (CdSe), способны поглощать свет и флуоресцировать.
Из-за различия в химическом строении и природе основного и возбужденного электронного состояния, фотофизические свойства квантовых точек отличаются от свойств органических флуорофоров и флуоресцентных белков. Во-первых, квантовые точки дают узкий и симметричный спектр эмиссии, положение максимума которого зависит от диаметра квантовой точки и материала, из которого она образована. Если варьировать концентрацию реагентов при синтезе, можно добиться формирования квантовых точек преимущественно одного диаметра, которые будут иметь свой специфический цвет флуоресценции. Так, например, для CdSe изменение размера ядра от 13 до 24 нанометров приводит к изменению флуоресценции от голубой (λem = 500 нм) до красной (λem = 610 нм). Важно то, что вид спектра возбуждения флуоресценции не зависит от диаметра; это означает, что можно добиться одновременного возбуждения различных типов квантовых точек, используя лишь одну волну возбуждения, что очень удобно для использования во флуоресцентной микроскопии.
101
Другое преимущество квантовых точек над органическими флуоресцентными красителями – высокие квантовые выходы флуоресценции и высокая устойчивость к фотообесцвечиванию.
В то же время квантовые точки имеют и ряд недостатков. Во-первых, это большие физические размеры, превышающие величину большинства биологических молекул. Во-вторых, материалы, из которых изготавливаются квантовые точки (Cd, Pb, Se, Hg), очень токсичны для живых клеток и организмов. Для уменьшения токсичности применяется многоступенчатый дизайн квантовых точек. Полупроводниковое ядро покрывается двойной защитной оболочкой из родственного материала (для селенида кадмия таким материалом служит сульфид цинка) и гидрофильной полимерной оболочкой, которая увеличивает растворимость квантовой точки в водной среде и дает возможность химически привязывать к поверхности другие молекулы.
Квантовые точки широко используются во флуоресцентной микроскопии и молекулярной диагностике in vitro; также разрабатываются методы для использования их в молекулярном имиджинге и диагностике in vivo.
Кроме квантовых точек, существуют другие флуоресцентные частицы нанометровых размеров. Например, кремниевые наночастицы с ковалентно привязанными к поверхности органическими красителями, которые имеют существенно более низкую токсичность по сравнению с квантовыми точками. Известны также наночастицы, образованные из полимерных органических соединений. Среди других примеров можно назвать золотые и серебряные нанокластеры, синтезированные на матрице с ДНК, которые демонстрируют флуоресцентные свойства и при этом состоят всего из нескольких атомов металла.
102
4. СПЕКТРОСКОПИЯ ЯДЕРНОГО МАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА
4.1. Краткое введение в метод
Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) или ЯМРспектроскопия – это один из спектроскопических методов исследования химических объектов, основанный на применении явления ядерного магнитного резонанса.
В настоящее время метод ядерного магнитного резонанса, наряду с масс-спектрометрией (МС) и инфракрасной спектроскопией (ИК) – один из наиболее информативных методов исследования молекулярной структуры. Ему посвящено огромное число монографий различного уровня, издается ряд специализированных научных журналов, а в сети Интернет имеется бесчисленное число сайтов с обучающими программами и информацией по многим различным и крайне разнообразным вопросам, связанным с этим методом. Практически во всех научных статьях, посвященных синтезу и выделению новых органических соединений, приводятся данные по различным спектрам ЯМР полученных продуктов. Можно даже признать, что наличие разрешенных ЯМР-спектров для каждого нового или заново получаемого соединения выступает неотъемлемой частью любой научной работы в области современной органической химии, а также в таких смежных областях, как физическая органическая химия, химия природных и высокомолекулярных соединений, а также многих других.
Наиболее востребована для химии и практического использования ЯМР и его приложений спектроскопия на ядрах атомов водорода 1Н, углерода-13 (13C), фтора-19 (19F) и фосфора-31 (31P).
Изучение основ метода ЯМР стало неотъемлемой частью химического образования в высшей школе во многих странах мира, что обусловлено важностью и значением этого метода для создания и поддержания высокого уровня исследований в химических лабораториях.
103
Метод ЯМР продолжает бурно развиваться, и объем информации продолжает по-прежнему стремительно быстро расти, поэтому даже в краткой форме невозможно осветить все аспекты этого метода.
С чисто интеллектуальной точки зрения, один из наиболее удивительных аспектов, касающихся ядерного магнитного резонанса, – это сложность предмета. Эта сложность, обусловленная трудностью восприятия и понимания физической природы явления, часто служит камнем преткновения для желающих понять и использовать методы ЯМР на практике.
Как и с другими физическими техниками, привлекаемыми для исследования химических и биологических систем, ЯМР может применяться просто эмпирически; например, просто для детектирования изменения параметров ЯМР при изменении какой-то экспериментальной переменной. Однако лучшее понимание феномена ЯМР и возможностей его применения часто вознаграждается дополнительным выигрышем в информации о структуре изучаемой системы. Хотя есть некоторый минимальный объем знаний о методе ЯМР, который необходим, чтобы критически читать и осмыслять специальную литературу или планировать и проводить ЯМР-исследования, существует гораздо больший континуум знаний о ЯМР, которыми следует овладеть, чтобы иметь возможность грамотно и корректно применять на практике весь потенциал метода для проведения разнообразных ЯМР экспериментов. В настоящее время с помощью данного метода можно изучать сложные структуры молекул белков и других природных соединений, устанавливать конформацию лабильных соединений в растворе, определять пространственную организацию сложных молекулярных ансамблей, измерять расстояния между отдельными функциональными группами одной молекулы, определять состав и количество молекул и молекулярных комплексов в сложных смесях, а также решать ряд других интересных и важных научных и прикладных задач.
Подобно инфракрасной спектроскопии, ЯМР выявляет информацию о молекулярном строении химических веществ. Однако он обеспечивает более полную информацию, позволяя изучать динамические процессы в образце – определять константы скорости химических реакций, величину
104
энергетических барьеров внутримолекулярного вращения. Эти особенности делают ЯМР-спектроскопию удобным средством, как в теоретической органической химии, так и для анализа биологических объектов. Применение ЯМР в настоящее время включает:
•Магнитно-резонансная томография (МРТ);
•Строение химических соединений:
–Химия природных веществ,
–Органический синтез,
–Строение материалов (твердотельный ЯМР);
• Определение трехмерной структуры:
–Белки и их комплексы,
–Нуклеиновые кислоты,
–Полисахариды;
• Динамические процессы:
–Кинетика реакций,
–Изучение равновесий.
Данный раздел представляет собой только краткое первоначальное введение в явление и метод ЯМР. Будут рассмотрены базовые понятия и процессы, лежащие в его основе, а также основные методики, которые находят сейчас применение в практических целях.
Ядерный магнитный резонанс можно кратко описать следующим образом. Если образец какого-либо химического вещества (необязательно органической природы) находится в магнитном поле и подвергается радиочастотному (РЧ) облучению, то при определенной частоте внешнего облучения ядра атомов в образце могут поглощать энергию. Частота облучения, необходимая для поглощения энергии, определяется тремя параметрами. Во-первых, это тип ядра (например, 1H или 13C). Во-вторых, частота зависит от химического окружения ядра. Например, метильные и гидроксильные протоны метанола поглощают при разных частотах, а амидные протоны двух разных остатков триптофана в нативной конформации белка поглощают при разных частотах, так как они находятся в разном химическом окружении. Частота ЯМР также зависит от пространственного положения в магнитном поле, если это поле не абсолютно однородно. Эта последняя переменная создает основу для таких
105