3 Гибридизация соматических клеток
Под гибридизацией соматических клеток понимают слияние соматических клеток. На современном уровне доказано, что можно получать вегетативные гибриды. При слиянии протопластов могут скрещиваться даже разные виды, мешают сливаться целлюлозные оболочки, но есть вещества, которые растворяют оболочки. Например в Японии используют вирус Сендай, его вводят в смешанную культуру двух типов клеток, образуются многоядерные гибридные клетки (гетерокарионы), содержащие в общей цитоплазме ядра обеих родительских клеток. По технике гибридизации вирус Сендай предварительно обрабатывают алкилирующими мутагенами или ультрафеолетовыми лучами, при этом вирус теряет инфекционные свойства, но способен сливать соматические клетки. Большинство многоядерных клеток погибает, но те из них, которые содержат по одному ядру обеих исходных клеток, часто выживают и размножаются делением.
После митоза и деления цитоплазмы из двухядерного гетерокариона образуются две одноядерные клетки (синкарионы), то есть настоящие гибридные соматические клетки, каждая из которых содержит один набор хромосом линии А и один набор хромосом линии В. Получены межвидовые гибриды клеток мыши и человека, крысы и человека, крысы и мыши. Межвидовые гибриды соматических клеток используют для генетического анализа и картирования хромосом человека.
При гибридизации соматических клеток растений разрушение клеточных стенок проводят ферментами, а слияние протопластов добиваются обработкой полиэтиленгликолем. В Канаде, например, получили гибрид двух видов табака, который был похож на половой гибрид. Таким путем получен картофель.
4 Гибридизация на уровне молекул ДНК
Гибридизацией на уровне молекул ДНК занимается генная инженерия. Можно пересадить ген одного организма в другой. Перенос генов при генной инженерии осуществляется не половыми клетками, как при обычном скрещивании, и не ядром, как при соматической гибридизации, а с помощью искусственно создаваемых генетических элементов (векторных молекул), то есть с помощью специально сконструированных плазмид (внехромосомных молекул ДНК, способных к авторепликации и передающиеся в дочерние
клетки при делении бактерий), в геном которых можно внедрить чужеродную генетическую информацию.
В качестве векторов используют кишечную палочку или дрожжи. Таким путем синтезировали инсулин и «прирастили» на ДНК кишечной палочки. Путем генной инженерии получают интерферон. Для растений решается проблема биологической фиксации атмосферного азота, необходимого для ассимиляции.
С помощью ферментов можно «приращивать» почти любые участки ДНК одной клетки и переносить в другие клетки с помощью кишечной палочки или дрожжей.
Генная инженерия применяется для получения генетически модифицированных деревьев, обладающих новыми признаками, которые нельзя получить традиционными способами селекции. К настоящему времени известно несколько подходов повышения продуктивности деревьев
спомощью методов генной инженерии:
1)ускорение прироста древесины путем повышения доступности питательных веществ или переключения метаболизма только на вегетативный рост;
2)улучшение качества древесины;
3)сокращение потерь во время выращивания путем повышения устойчивости к вредителям и болезням;
4)сокращение потерь во время лесозаготовок путем создания растений
снаиболее оптимальными характеристиками габитуса.
Наиболее разработанным подходом является повышение доступности неорганического азота для растений. С этой целью используется ген глутаминсинтазы, который катализирует превращение аммония в глутамин, являющийся предшественником глутамата и всех азотсодержащих компонентов, необходимых для роста растения. Исследования в этом направлении интенсивно ведутся в ряде стран, и полевые испытания трансгенного тополя с усиленной экспрессией глутаминсинтазы, проведенные в Испании, показали на третий год вегетации ускорение в росте на 41 % по сравнению с контролем. В Институте биоорганической химии им. академика М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН получен ряд трасгенных линий ценных генотипов березы пушистой (Betula pubescens) и осины (Populus tremula) с геном глутаминсинтазы GSI из сосны
обыкновенной. Сейчас проводится анализ экспрессии и отбор перспективных линий.
5 Мутагенез в селекции древесных растений
Мутации – это прерывистые, скачкообразные изменения наследственности, передающиеся по потомству. Этот термин впервые ввел в
науку голландский генетик Гюго де Фриз (1903). Он систематизировал мутации и предсказал, что мутации можно получать искусственно. Мутации вызываются внешними факторами.
Примерами мутаций являются: пирамидальные, плакучие, шаровидные формы тополя черного, каповые формы ореха, сосны, осокоря, ольхи, тополя белого и др.; бесколючковые формы гледичии, шиповника; пестролистные формы у тополя, крушины; рассеченолистные формы у березы, ольхи, бузины и др. Мутации в природе охватывают все признаки дерева. Мутации
–это первоисточник наследственных изменений.
Вклассической генетике выделяют три типа мутаций:
1.Генные или точковые мутации связаны с изменением структуры молекулы ДНК, когда происходит замена или включение одной пары азотистых оснований или выпадение (делеция) нескольких пар.
2.Хромосомные мутации или хромосомные абберации – изменение структуры хромосом. Среди них различают транслокации, когда происходит обмен участками разных хромосом; инверсии, когда определенный участок хромосомы поворачивается на 180◦; делеции – выпадает внутренний участок хромосомы; дупликации – удвоение участка хромосом; нехватка – выпадение небольшого концевого или внутреннего участка хромосомы. Структурные изменения хромосом в большинстве случаев можно обнаруживать под микроскопом.
3.Геномные мутации (перестройки генома) – изменение количества хромосом в два и более раз – полиплоидия; уменьшение диплоидного количества в два раза (гаплоидия), анеуплоидия (уменьшение) или увеличение хромосомного комплекса на одну или большее число хромосом.
Однако С.И. Малецкий и др. (2005) считают, что полиплоидию корректнее обозначать термином «эпигенетическая изменчивость».
Все три мутации – ядерные. Мутации в цитоплазме называются внеядерными или плазмогенными. Мутации, возникающие в гаметах и клетках, из которых они образуются, называются генеративными. Мутации,
происходящие в соматических клетках организма, называются соматическими. По своей природе генеративные и соматичекие мутации, ничем не отличаются. И те, и другие связаны с изменением структуры хромосом, и возникают они примерно с одинаковой частотой. Но по характеру проявления и значимости для эволюции и селекции различия между ними очень существенны. Генеративные мутации при половом размножении передаются следующим поколениям организмов. Доминантные мутации проявляются уже в первом поколении, а рецессивные – только во втором и последующих поколениях, при переходе их в гомозиготное состояние. Соматические мутации возникают в диплоидных клетках, поэтому проявляются только по доминантным генам или по рецессивным генам в гомозиготном состоянии. Они имеют значение для вегетативно размножаемых растений.
Спонтанные или естественные мутации у древесных растений возникают в результате резкого перепада температур, влияния ультрафиолетовых лучей и других внешних факторов. Возникают пестролистные, пирамидальные, полиплоидные и др. формы (рис. 41, 42).
5.1Индуцированные мутации
В1925 г. Г.А. Надсон и Г.Е. Филиппов на бактериях и в 1927 г. Г. Меллер на дрозофиле доказали возможность искусственного получения мутаций путем воздействия лучами Рентгена.
Различают физические и химические мутагены. Физические мутагены вызывают чаще генные мутации. К ним относятся: лучи Рентгена, радия, протоны, нейтроны, ультрафиолетовые лучи, температура, γ – лучи. Считают, что химические мутагены по характеру действия на клетку сильнее
иэффективнее физических мутагенов. Сверхмощные мутагены называют супермутагенами, к ним относятся: колхицин, янтарная кислота, этиленимин, N-нитрозо-N-метилмочевина и др. Применение физических мутагенов: используют специальные установки для облучения семян, черенков, проростков и др.
Способы применения химических мутагенов: замачивание (определенной концентрации и экспозиции); инъекции в почку, тампоны, газовая обработка.
С древесными породами большую работу проводили: в Донецке проф. Ф.Л. Щепотьев (им получен сорт тополя Донецкий золотистый при облучении рентгеновскими лучами тополя волосистоплодного, бесколючковый шиповник, дуб плакучий стелющийся, быстрорастущие дубки), в Новосибирске Г.Ф. Привалов, в Воронеже Е.М. Гуляева получили тетраплоидный тополь бальзамический. Е.М. Гуляевой и др. (1984) получены мутанты тополя бальзамического под воздействием химических мутагенов: N-нитрозо-N-метилмочевины (НММ), N-нитрозо-N-этилмочевины (НЭМ) и др.
Полученные мутантные формы, индуцированные НЭМ и НММ, представляют собой соматические мутации генного происхождения. Названные выше мутагены обладают высокой мутационной активностью, они могут вызвать крупные и «системные» мутации. Хозяйственно-ценные признаки у тополя бальзамического, индуцированные мутагенами, могут закрепляться при вегетативном размножении, однако, отдельные из них по истечении 20 лет расхимерились.
6 Селекция и размножение полиплоидов
Наследственная изменчивость, связанная с кратным основному увеличением чисел хромосом, обычно называется полиплоидией (от греч. рolyploos – многократный и eidos - вид). Соматические клетки обычно имеют диплоидный набор хромосом, который состоит из пар гомологичных хромосом, полученных от отцовского и материнского организмов. Половые клетки имеют в два раза меньше хромосом, чем соматические, и, следовательно, несут в себе лишь часть наследственной программы. Половинный набор хромосом, имеющийся в половых клетках, называется гаплоидным и обычно обозначается через n. Различают также основной (базисный) набор хромосом (x), У многих организмов основной набор хромосом (x) соответствует количеству хромосом в половых клетках (n).
Полиплоидия широко распространена в природе. Цитологическими исследованиями установлено, что более половины видов покрытосеменных растений – полиплоиды (Гуляев, 1984). Полиплоиды называются и обозначаются по количеству основных наборов хромосом (x), которые содержатся в их клетках: триплоиды (3x), тетраплоиды (4x), пентаплоиды (5x), гексаплоиды (6x) и т.д.