Материал: А27103 Василинец И. М., Колодязная В.С. Методы исследования

Проведение электрофореза. Электрофорез проводят при оптимальных для каждого вида белковых веществ условиях разделения: для белков семян сои – при напряженности 6 В/см и силе тока 12…17 мА; для белков семян хлопчатника – при напряженности 4 В/см и силе тока 4,5 мА; для семян подсолнечника – при напряженности 6 В/см и силе тока 3 мА. Хорошее разделение при указанных условиях происходит за 20 ч при комнатной температуре.

Фиксация и окраска электрофореграмм. Перед окрашиванием электрофореграммы подсушивают в сушильном шкафу при 10…110 °С в течение 5 мин. Для окрашивания белков используют бромфеноловый синий (0,05 %-й раствор бромфенолового синего в 2 %-м растворе уксусной кислоты, содержащем 1 % сулемы). Электрофореграммы погружают в ванну с раствором красителя на 5…10 мин, затем удаляют избыток красителя промыванием электрофореграмм в 2 %-м растворе уксусной кислоты (три–четыре раза по 2…3 мин). Более продолжительное промывание приводит к вымыванию бромфенолового синего из белковых фракций, особенно из фракций с низким содержанием белков. Отмытые электрофореграммы подсушивают при 110 °С в течение 3…4 мин и обрабатывают парами аммиака. При этом белковые фракции окрашиваются в синий цвет.

Анализ фракций. Содержание белка в отдельных фракциях определя-ют по количеству сорбированного в них красителя, которое прямо пропорционально количеству белка, содержащегося в данной фракции. Содержание красителя в отдельных фракциях обычно определяют методом элюирования или прямым фотометрированием с помощью денситометра. В обоих случаях для количественной оценки пригодны электрофореграммы, на которых отдельные фракции прямолинейны и параллельны друг другу.

Для элюирования электрофореграмму разрезают на поперечные поло-ски шириной 3…5 мм. Краситель из каждой полоски элюируют 4 мл 0,01 н. водного раствора NаОН, настаивают 30 мин и затем определяют оптическую плотность растворов на спектрофотометре СФ-4 при λ = 590 нм (максимум поглощения бромфенолового синего). На основании полученных данных вычерчивают кривые в координатных осях: оптическая плотность – расстояние на электрофореграмме. По числу максимумов на кривой судят о числе белковых фракций. Для вычисления содержания отдельных фракций площадь отдельных фракций делят на общую площадь, ограниченную кривой.

Для получения достоверных данных необходимо проанализировать не менее 10 электрофореграмм. Средняя абсолютная ошибка при определении процентного содержания каждой фракции не должна превышать ±4 %.

11. Спектроскопия

Спектроскопия – метод, благодаря которому получили современное представление о строении вещества. Это объясняется тем, что в основу спектроскопии положены те свойства электронных оболочек атомов и молекул, которые проявляются при взаимодействии излучения с веществом.

Исследуя молекулярные спектры, можно получить обширные сведения о строении и свойствах молекул, о их форме и размерах (межатомных расстояниях, валентных углах, характере изомерии), о природе и величине энергии химических связей, о частотах собственных колебаний молекул, о взаимном влиянии атомов в молекулах и межмолекулярных связях последних. Наряду с этим спектроскопические исследования имеют большое практическое значение и проводятся в целях идентификации химических соединений, определения их чистоты, количественного анализа простых и сложных смесей, а также для изучения кинетики некоторых химических процессов.

Методы спектрального анализа в сочетании с химическими и физико-химическими методами позволяют решать очень широкий круг вопросов и поэтому находят применение в самых различных отраслях науки и промышленности.

11.1. Общие понятия и терминология

Оптическая часть спектра электромагнитного излучения включает вакуумную область ультрафиолетового излучения, ультрафиолетовую, видимую, инфракрасную области. В настоящее время в спектроскопии используются излучения в широком диапазоне длин волн от 0,15 до 50 мкм, поэтому длина волны видимого и ультрафиолетового излучения обычно измеряется в ангстремах (Å) и нанометрах (нм). При этом 1 мм = 10³ мкм = = 10⁶ нм = 10⁷ Å.

Длина волны λ зависит от показателя преломления среды, в которой распространяется свет, поэтому обычно значения λ приводят к их значениям в вакууме.

В спектроскопических работах, кроме того, используются следующие параметры:

– волновое число ν = 1/λ, равное числу длин волн (в пустоте), приходящихся на 1 м, и измеряемое в обратных метрах ( м^–1);

– частота колебаний ω, равная числу полных колебаний в секунду и измеряемая в обратных секундах (с^–1);

– иногда в качестве единицы измерения частоты используют фре- нель f, равный 10¹² колебаниям в секунду.

Спектральное разложение света, т. е. разложение его в спектр по длинам волн или частотам, может быть выполнено при помощи спектрального прибора. Если излучение источника, освещающего щель прибора, содержит лучи лишь ограниченного набора длин волн, то полученный спектр будет состоять из отдельных линий или полос (дискретный спектр).

Дискретные спектры могут быть получены, например, при разряде в газовой среде. Если же источник света испускает лучи всех возможных длин волн, то прибором регистрируется непрерывный спектр источника. Эти спектры являются спектрами испускания возбужденных атомов молекул. Непрерывный спектр в видимой области имеет обычная лампа накаливания, в ультрафиолетовой – водородная лампа, в инфракрасной – силитовые стержни и штифты Нернста.

Исследования, основанные на измерении спектров испускания атомов и молекул, составляют раздел эмиссионной спектроскопии. Если перед щелью прибора, регистрирующего непрерывный спектр источника, поставить кювету с веществом, поглощающим лучи определенных длин волн, то при этих длинах волн в непрерывном спектре источника будет наблюдаться ослабление интенсивности – появление полос поглощения. Совокупность полос поглощения составляет спектр поглощения вещества.

Исследования, основанные на измерении секторов поглощения, составляют раздел абсорбционной спектроскопии или спектроскопии поглощающих сред.

Наряду с поглощением и испусканием, молекулы способны рассеивать свет. Явление рассеяния света с изменением частоты падающего светового потока и появлением дополнительных линий в спектре излучения, рассеянного веществом, носит название комбинационного рассеяния. Комбинационное рассеяние и люминесцентный анализ относятся к разделу эмиссионного молекулярного спектрального анализа.

Измерение спектров производится при помощи спектральных приборов. Каждый спектральный прибор состоит из коллиматора, диспергирующей системы, камерного объектива и регистрирующего устройства. В последнее время спектральные приборы оснащаются ЭВМ для расшифровки спектров.

Назначение коллиматора – превратить световой поток, падающий от источника света 1 на щель прибора 2, находящегося в фокусе объектива коллиматора 3, в параллельный пучок, идущий в диспергирующую систе-му 4 (рис. 11.1). Диспергирующая система разлагает параллельный пучок на совокупность параллельных пучков разных длин волн, выходящих из нее под разными углами. Объектив 5 фокусирует выходящие пучки, давая в фок альной плоскости 6 монохроматическое изображение входной щели, соответствующее различным длинам волн.

Рис. 11.1. Схема спектрального прибора:

1 – источник света; 2 – щель прибора; 3 – объектив коллиматора; 4 – диспергирующая система; 5 – объектив камеры; 6 – фокальная плоскость.

По методу регистрации можно выделить два типа спектральных приборов – спектрографы, спектрометры.

По типу системы разложения света (диспергирующей системы) приборы делятся на две группы: приборы с преломляющей системой – призменные, в которых разложение света осуществляется при помощи призм; приборы с отражающей системой – с вогнутыми и плоскими дифракционными решетками или эшелеттами.

В качестве фокусирующей используется преломляющая оптика – объективы из стекла, кварца и других материалов, а также отражающая – плоские, сферические, параболические зеркала с наружным покрытием.

Качество спектрального прибора определяется его светосилой, разрешающей способностью и величиной линейной дисперсии. Знание силы прибора необходимо для установления возможности использования его для получения и регистрации спектров слабо освещающихся объектов. Мерой светосилы является величина освещенности в фокальной плоскости. Светосила прибора пропорциональна квадрату относительного отверстия камеры.

Разрешающая способность спектрального прибора определяется разностью в длинах волн δλ двух близких спектральных линий, которые еще могут быть разрешены. В соответствии с критерием Рэлея линии считаются, если ордината минимума составляет 0,8 от максимальных ординат суммарной кривой (рис.11.2).

δλ

1,0

0,8

Рис. 11.1. Схема, иллюстрирующая разрешающую способность прибора

Разрешающая способность спектрального прибора складывается из разрешающей силы диспергирующей системы и регистрирующего устройства.

11.2. Эмиссионный спектральный анализ

Спектры испускания атомов, так же как и их химические свойства, определяются строением наиболее удаленных от ядра электронных оболочек, т. е. свойствами наименее связанных с ядром внешних (валентных) электронов.

Испускание света атомами происходит за счет изменения внутриатомной энергии, обусловленной взаимным расположением ядра и окружающих его электронов. При этом атомы могут находиться только в определенных энергетических состояниях. Для атомов каждого элемента (точнее, для совокупности ядра, окруженного внутренними электронами, и каждого внешнего электрона) характерен свой набор дискретных значений энергии.

Атомы, находясь в нормальном состоянии (на нулевом энергетическом уровне Е₀), не излучают. Для того чтобы вызвать излучение атома, его необходимо возбудить, т. е. перевести один из его внешних электронов на более высокий энергетический уровень Е. Длительность возбужденного состояния невелика (10^–7…10^–8 с), и электрон возвращается в исходное Е₀ или промежуточное Е состояние с меньшей энергией. Энергия, равная разности значений энергии этих уровней, излучается в виде кванта с частотой

 = или  =

и соответствует одной спектральной линии.

Совокупность изменений всех возможных энергетических состояний множества атомов данного элемента составляет его спектр. О количестве возможных энергетических состояний атомов различных элементов можно судить по числу линий в их спектрах. Так, спектр железа в области 2100…6600 А состоит приблизительно из 4600 линий.

Энергия атома в нормальном состоянии условно принимается за нуль. Энергия возбужденных уровней (потенциал возбуждения) измеряется в электрон-вольтах (эв) или обратных сантиметрах (см^–1)

1эВ = 1,60207 · 10^–18 Дж = 23,05 ккал/моль = 8067,5 см^–1.

Уровень, ближайший к нормальному, называют резонансным, а линию, соответствующую переходу с него на нормальный уровень, – резонансной линией данного элемента. Состояние с максимальной энергией возбуждения соответствует энергии ионизации (потенциалу ионизации) атома, т. е. энергии отрыва электрона от атома. При удалении из атома одного электрона заряд атомного остатка, а следовательно, и притяжение электронов возрастает. Поэтому для удаления последующего электрона из атома требуется большая энергия. При наличии нескольких электронов на внешней оболочке, имеющих разные энергии связи с ядром, имеется несколько значений соответствующих потенциалов ионизации. Так, потенциал ионизации нейтрального атома железа равен 7,86 эВ. Ионизационный атом железа будет иметь спектр, обусловленный совокупностью энергетических состояний второго валентного электрона с потенциалом его ионизации 16,24 эВ. Спектр двукратно ионизованного атома железа обусловлен состояниями третьего валентного электрона, имеющего потенциал ионизации 30,6 эВ.

Возбуждение атомов и ионов, т. е. перевод их в состояние с повышенной внутренней энергией, может быть проще всего осуществлено при соударении с быстро летящими частицами (электронами, ионами, атомами), обладающими большой кинетической энергией. Эти условия имеют место в таких источниках света, как электрическая дуга, высоковольтная искра, разрядная трубка, пламя и др., в которых вещество находится в состоянии плазмы и представляет собой смесь нейтральных (атомов и молекул) и заряженных (электронов, ионов) частиц.

Спектр дуги представляет собой в основном излучение нейтральных атомов, спектр искры – ионов. При возбуждении наиболее вероятным является переход на резонансный и близкие к нему уровни (термы). Поэтому в спектре излучения наиболее интенсивными являются линии, соответствующие переходам именно с этих термов. Эти линии, как правило, и выбираются в качестве аналитических, так как обеспечивают наибольшую чувствительность анализа. Однако интенсивность этих линий в спектрах различных элементов различна и тесно связана с особенностями строения электронных оболочек, характеризующих прочность связи внешних электронов с ядром. Чем менее прочна эта связь, тем ниже потенциал возбуждения, тем больше заполненность возбужденного уровня и выше вероятность излучения соответствующей линии, а следовательно, выше и чувствительность определения элемента.

В физике существуют специальные таблицы данных о чувствительности определения ряда элементов по некоторым аналитическим линиям при проведении качественного анализа.

Выбор источника возбуждения спектра зависит от свойств элемента. Так, источником возбуждения свечения элементов с низкими потенциалами возбуждения служит газовое пламя; для анализа газовых смесей пригодны газоразрядные трубки низкого давления, в которых свечение атомов инертных газов, водорода, кислорода, азота и других, имеющих высокие потенциалы возбуждения основных линий, вызывается столкновениями с электронами высокой энергии. Электрическая дуга является более распространенным источником возбуждения, так как она позволяет получить спектры почти всех элементов. Дуга широко применяется при анализе руд, минералов, порошкообразных проб и т. д. Высоковольтная конденсированная искра в основном применяется при количественном анализе металлов.

В исследовании пищевых продуктов интерес представляет эмиссионный анализ, как один из методов определения содержания в них микроэлементов.

Поставленная задача и специфика анализируемых образцов определяют выбор метода получения спектров. При определении содержания щелочных и щелочноземельных элементов используют метод пламенной фотометрии; при определении содержания тяжелых элементов – анализ порошкообразных проб (золы) в дуге между угольными электродами.