Материал: Бактериофаги

26

Фагодиагностика. Бактериофаги используются при диагностике сибирской язвы, брюшного тифа, дизентерии и других инфекционных заболеваний. Высокая чувствительность бактерий к специфическому фагу позволяет отличить близкородственные виды, (возбудителя чумы от возбудителя псевдотуберкулеза, холерный вибрион от холероподобного). С помощью бактериофагов можно определить типы (варианты) внутри одного вида бактерий (измененные штаммы бруцелл и сибиреязвенного микроба).

При проведении фагодиагностики культивирование бактерий осуществляют на плотной или в жидкой питательных средах. Размножение фагов в бактериальных культурах на плотных питательных средах сопровождается лизисом бактерий и образованием зон просветления (стерильных пятен, бляшек или негативных колоний). Разные фаги формируют негативные колонии определенных размеров и формы. Размножение бактериофагов в жидких культурах сопровождается просветлением среды, бывшей перед заражением фагом мутной.

В лабораториях применяют несколько методов выявления специфического действия фагов:

1. Метод Отто (метод стекающей капли) используется для идентификации неизвестных бактерий с помощью известных диагностических фагов (фагоидентификация, фаготипирование). Для выполнения этого метода на чашку с МПА наносится капля суточной бульонной культуры и шпателем круговыми движениями распределяется по поверхности агара. Затем наносится капля суспензии известного бактериофага и наклоном чашки дают капле стечь по поверхности агара. Посевы инкубируют в термостате в течение суток, после чего учитывают результаты. При соответствии фага и бактерий в месте нанесения диагностического фага наблюдается отсутствие роста культуры (рисунок 44).

Рисунок 44 - Фагоидентификация бактерий по методу Отто.

2. Метод Фишера также используется для идентификации неизвестных бактерий с помощью известных фагов. Для выполнения этого метода каплю испытуемой суточной бульонной культуры наносят на МПА и шпателем распределяют по поверхности агара. Затем чашку условно делят на квадраты. В каждый квадрат наносят по капле суспензий разных фагов. После суточного культивирования в термостате учитывают результаты. При соответствии бактерий и фага обнаруживаются зоны лизиса (рисунок 45).

27

Рисунок 45 – Фаготипирование бактерий по методу Фишера.

3.Метод Фюрта также используется для типирования неизвестных бактерий

спомощью известных фагов. При выполнении этого метода в расплавленный и остуженный до 45-50ОС МПА добавляют суспензию известного бактериофага и тщательно перемешивают. Полученную смесь разливают в чашки Петри. Каждую чашку условно делят на несколько секторов, в которые высевают штрихом исследуемые культуры. Чашки инкубируют в термостате, после чего учитывают результаты. Рост культуры будет отсутствовать в том секторе, в котором бактерии и фаг соответствуют друг другу (рисунок 46).

Рисунок 46 – Фагоидентификация бактерий по методу Фюрта.

Фаготипирование используют также для выявления источника и путей распространения инфекции (эпидемиологическое маркирование). При этом выделение бактерий одного фаговара от разных больных указывает на общий источник их заражения.

Санитарно-показательное значение бактериофагов. По содержанию некоторых бактериофагов во внешней среде можно судить о присутствии в них соответствующих бактерий. Например, наличие фагов кишечных бактерий свидетельствует о фекальном загрязнении объектов внешней среды. Поэтому бактериофаги кишечных бактерий используются в качестве санитарнопоказательных микроорганизмов (СПМ). Во внешней среде бактериофаги выжи-

28

вают в течение 8-9 месяцев, поэтому их обнаруживают как при свежем фекальном загрязнении, так и после отмирания бактерий кишечной группы. При этом одновременное обнаружение фага и кишечной палочки указывает на свежее фекальное загрязнение, а обнаружение одного фага - на давнее фекальное загрязнение.

При исследовании питьевой воды определяют присутствие и количество колифагов – фагов, лизирующих кишечные палочки рода Escherichia. Колифаги являются индикаторами загрязнения воды патогенными энтеровирусами и очистки питьевой воды от энтеровирусов. Для определения количества колифагов определенное количество питьевой воды смешивают с расплавленным питательным агаром и культурой кишечной палочки. Смесь разливают в чашки Петри и инкубируют в термостате. Через 72 часа учитывают зоны лизиса, образовавшиеся на сплошном газоне Е. coli. Результаты выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 100 см3 воды.

Индикация бактерий с помощью реакции нарастания титра фага.

Присутствие каких-либо микроорганизмов в исследуемой пробе (вода, пищевые продукты) можно установить с помощью бактериофагов. Этот прием основан на специфичности действия бактериофагов: бактериофаг E. coli лизирует только кишечную палочку, холерный бактериофаг вызывает лизис только холерного вибриона и т. д. Для установления присутствия определенных бактерий в исследуемую пробу добавляют известное количество специфического фага. При наличии гомологичных бактерий фаг размножается, в результате чего нарастает его титр (количество). Следовательно, реакция нарастания титра фага основана на увеличении количества фага при его контакте с возбудителем непосредственно в исследуемом материале.

Реакцию нарастания титра фага используют при диагностике дизентерии и брюшного тифа, для выявления бактерионосительства при брюшном тифе, для обнаружения брюшнотифозных и дизентерийных бактерий в воде и молоке, для обнаружения дизентерийных микробов на предметах внешней среды, для выявления чумного микроба и холерного вибриона в воде.

Фагопрофилактика – это предупреждение бактериальных инфекций путем применения бактериофагов. В профилактических целях бактериофаг используется в тех случаях, когда возбудитель известен. Фагопрофилактика проводится в комплексе с другими методами. В настоящее время по эпидемическим показаниям фагопрофилактику проводят только при дизентерии и брюшном тифе. Фагопрофилактика имеет ряд преимуществ: возможность использования в больших количествах, быстрота действия, легкость введения, полная безвредность.

Фаготерапия – это способ лечения некоторых бактериальных инфекций (брюшного тифа, дизентерии, холеры и др.) специфическими бактериофагами. При использовании бактериофагов в лечебных целях предварительно определяют чувствительность возбудителей к данному бактериофагу. В настоящее время применение фагов с лечебной целью проводится редко. Это связано с широким применением антибиотиков и возрастанием количества фагоустойчивых бактерий.

При лечении часто используют смесь из разных фагов: против протея, кишечной палочки и энтерококка; против синегнойной палочки и других гноеродных микробов. Поливалентные препараты могут включать бактериофаги

29

против различных вариантов бактерий одного вида (например, против пяти серологических групп сальмонелл).

Для профилактического и терапевтического применения бактериофаги выпускаются в виде таблеток, жидких форм и др. (рисунок 47).

Рисунок 47 – Готовые лекарственные формы препаратов бактериофагов.

В последние годы фаги находят широкое применение в косметологии в виде гелей (рисунок 48).

Рисунок 48 – Гели с бактериофагами.

Генная инженерия. Трансдуцирующие фаги широко используются в генной инженерии. В частности, феномен неспецифической трансдукции применяется для картирования генома бактерий.

Выделение и производство бактериофагов

Выделение бактериофагов. Бактериофаги выделяют из субстратов, контаминированных бактериями, или из лизогенных бактерий, содержащих профаг. В качестве субстрата используют отделяемое гнойных ран, испражнения, сточные воды, старые бактериальные культуры. Для индукции профага на бактериальную культуру воздействуют химическими веществами или физическими факторами

30

(митомицином С, УФЛ, ионизирующим излучением и др.). Индуцированный профаг обусловливает синтез фаговых частиц и вызывает лизис бактериальных клеток. После этого суспензию субстратов (или лизат бактериальной культуры) фильтруют через мелкопористые фильтры или центрифугируют. Полученный фильтрат (центрифугат) исследуют на способность лизировать чувствительные бактерии. С этой целью фильтрат наносят на плотную или вносят в жидкую питательную среду, засеянную бактериями, в которых способен размножаться фаг. О присутствии фага судят по лизису бактериальной культуры. На плотных питательных средах фаги обнаруживаются либо с помощью спот-теста (анг. spot – пятно), либо методом агаровых слоев по А. Грациа (рисунок 49).

Рисунок 49 - Обнаружение бактериофагов в исследуемом материале: 1 – спот-тест; 2 – титрование по Грациа.

При проведении спот-теста (капельного теста) на поверхность агара в чашке Петри высевают бактериальную культуру, а затем на нее наносят каплю суспензии бактериофага. В месте нанесения фага бактериальная культура лизируется и образуется стерильное пятно. Иногда каплю суспензии бактериофага наносят ближе к краю чашки, а затем чашку наклоняют, позволяя фаговой суспензии стечь по поверхности агара. В этом случае роста бактериальной культуры не будет в виде

“фаговой дорожки”.

Метод агаровых слоев по Грациа (A. Gratia, 1936) используется как для выделения фага, так и для определения его титра. При выполнении этого метода в чашку Петри наливают слой МПА. После застывания на этот слой наливают 2 мл расплавленного и охлажденного до 45ОС полужидкого (0,7%) агара, в который предварительно добавляют каплю бактериальной суспензии и определенный объем суспензии фага. После застывания верхнего слоя агара чашку инкубируют в термостате при температуре 37ОС в течение 18-24 часов (рисунок 50).