В геноме человека представлено около 2,000 HERV-K(HML-2) и их одиночных LTR, поэтому можно подсчитать, насколько смесь, содержащая только 5'-фланкирующие LTR последовательности, упрощена относительно исходной рестрицированной смеси геномной ДНК, и каких значений обогащения по фланкам чс (человек-специфичных) LTR можно ожидать в ходе ВГ. Сложность анализируемой смеси (С) зависит от количества геномных повторов (в нашем случае 2,000) и от частоты встречаемости в геноме рестриктных сайтов выбранной для фрагментации ДНК эндонуклеазы (в нашем случае примерно 1 сайт на 256 нуклеотидов). Таким образом, сложность нашей смеси составляет C= 256 x 2000 ~5x105 , что в 6000 раз меньше сложности человеческого генома.
Это приводит к драматическому (3.6x107) возрастанию скорости гибридизации упрощённой ДНК в сравнении с исходной рестрицированной смесью геномной ДНК. Массовым концентрациям трейсера и драйвера, соответственно, 1.5 нг и 150 нг в 1l, которые были использованы в данной работе, соответствуют молярные концентрации индивидуальных фрагментов в смеси 5x10-12 для трейсера и 5x10-10 для драйвера. При значении R=106, можно ожидать 20-кратное обогащение после 14 часов гибридизации. Важно подчеркнуть, что в случае использования неупрощённой смеси рассчётное значение обогащения составляет пренебрежимо малую величину.
Для того, чтобы проверить, насколько эти теоретические данные согласуются с реальностью, мы нашли экспериментальное значение обогащения результирующей смеси по фланкам чсLTR: мы определяли концентрацию фланкирующей последовательности известного чсLTR из локуса 19q13.2 (258) в исходном трейсере и в смеси, полученной в ходе ВГ. При этом, если метод TGDA работает, должно было происходить обогащение смеси по этой последовательности.
Действительно, в случае использования матрицы смеси после вычитания, видимый чс ПЦР продукт появлялся на 4 цикла раньше, чем в случае использования исходного трейсера, что свидетельствует о 16-кратном обогащении вычтенной библиотеки фланками чсLTR. Это значение хорошо согласуется с теоретически ожидаемым (~20-кратное обогащение), что свидетельствует о том, что приведённое выше уравнение верно описывает происходящие при TGDA процессы и может быть успешно применено для прогнозирования эффективности использования метода.
Дальнейший анализ полученной библиотеки, обогащённой фланками чс LTR, включал в себя определение первичной структуры вставок в 55 случайно выбранных клонах и экспериментальную проверку специфичности для генома человека соответствующих LTR. Все вставки содержали ожидаемые фрагменты LTR, что свидетельствует о высокой специфичности селекции на первой стадии TGDA. Длины фланкирующих LTR областей варьировали от 49 до 385 нуклеотидов, средняя длина составляла 138 нуклеотидов. Для 46 из этих последовательностей в базах данных GenBank были найдены гомологичные протяжённые последовательности, содержащие полноразмерные LTR. 29 из 46 клонов содержали уникальные вставки, 10 клонов встретились дважды, одна последовательность была найдена в 3 клонах, ещё одна - в 4-х. В сумме были идентифицированы 36 независимых последовательностей. Мы проверяли специфичность внедрений соответствующих LTR или провирусов HERV-K с помощью ПЦР с матриц геномной ДНК человека и других высших приматов (см. Рис. 1.2.2).
Рисунок 1.2.2. Схема ПЦР-анализа LTR-содержащих локусов генома человека. (I) LTR-содержащий локус, (II) LTR- несодержащий локус. Буквы (А) и (Б) обозначают различные примеры такого ПЦР-анализа. Дорожки 1, 2: матрица - ДНК человека 3, 4: матрица - ДНК шимпанзе, 5: матрица - ДНК гориллы, 6, 7: матрица - ДНК орангутана.
Выводы о наличии или отсутствии одиночных LTR в соответствующих геномных локусах делали на основании результатов ПЦР со специфическими праймерами, фланкирующими исследуемое внедрение ретроэлемента. При этом ДНК, содержащая LTR в соответствующем локусе, должна давать продукт примерно на 970 пн длиннее, чем продукт, полученный с матрицы, не содержащей LTR.
В случае, когда сайт интеграции содержал полноразмерный провирус HERV-K(HML-2) (размером около 10 тпн), мы проводили три ПЦР-амплификации с геномными праймерами G1, G2, и с LTR-специфичными праймерами T1 и T3. Присутствие провируса в анализируемом сайте приводит к успешной ПЦР-амплификации с парами праймеров G1+T1 и G2+T3, но не G1+G2. И наоборот, полученные продукты амплификации с праймерами G1+G2, но не G1+T1 или G2+T3 обозначают отсутствие провируса в этом локусе (данные не представлены).
Подводя итоги, в 55 случайно отобранных клонах мы нашли 23 чс последовательности. Эти 23 последовательности были представлены 33 клонами, что свидетельствует о том, что чс последовательности занимают ~60% полученной библиотеки.
Кроме того, мы провели дифференциальную дот-блот гибридизацию ПЦР-амплифицированных вставок из 288 клонов с тотальными зондами на LTR-фланкирующие последовательности человека и шимпанзе. Результаты дифференциальной гибридизации представлены на Рис. 1.2.3. 150 клонов (52%) гибридизовались только с “человеческим” зондом, но не с зондом на фланки LTR шимпанзе, что хорошо согласуется с представленной выше оценкой 60%. Мы отсеквенировали вставки 6 случайно отобранных дифференциальных клонов, 4 из них являлись повторениями ранее охарактеризованных чс клонов из нашей библиотеки, а 2 новых вставки имели гомологичные последовательности в GenBank и были идентифицированы нами как чс при помощи геномных ПЦР со специфическими LTR-фланкирующими праймерами.
Рисунок 1.2.3. Пример дот-блот гибридизации клонов с зондами, полученными на LTR-фланкирующие участки человека и шимпанзе. Окружностью обведены клоны, содержащие фланки чс LTR, согласно данным ПЦР-анализа; квадратом обведены клоны, содержащие фланки LTR, присутствующих также в геноме шимпанзе.
Всего нами было найдено в библиотеке 25 чс LTR, 23 из них были идентифицированы впервые. Полученная с помощью TGDA библиотека содержала 60% клонов, несущих вставки, специфичные для генома человека. Экспериментально наблюдаемое значение обогащения по целевым последовательностям хорошо согласуется с теоретически ожидаемым (~16- и 20-кратное, соответственно).
По материалам работы была опубликована статья:
Buzdin, A., Khodosevich, K., Mamedov, I., Vinogradova, T., Lebedev, Y., Hunsmann, G., Sverdlov, E. (2002) A technique for genome-wide identification of differences in the interspersed repeats integrations between closely related genomes and its application to detection of human-specific integrations of HERV-K LTRs. Genomics, 79(3):413-422.
1.3 Метод Diffir: дифференциальная гибридизация фланков геномных повторов на фильтре
Метод, названный «Differences in the integration sites of low and medium copy number interspersed repeats technique » (DiffIR), был разработан для тех же целей, что и TGDA, и применён для того же объекта - семейства эндогенных ретровирусов человека HERV-K (HML-2), для поиска специфичных для генома человека интеграций этих ретроэлементов. Метод можно использовать для идентификации любых дифференциальных внедрений геномных повторов при сравнении близкородственных геномов. Принцип DiffIR - комбинирование селективной амплификации геномных фрагментов, фланкирующих исследуемую группу повторов, и дифференциальной гибридизации клонов полученных библиотек.
При этом стадия селективной амплификации, включающая в себя фрагментацию геномной ДНК частощепящей эндонуклеазой рестрикции (в данном случае AluI), лигирование супрессионных адапторов и nested ПЦР, абсолютно идентична первому этапу TGDA, поэтому подробно останавливаться на ней нет необходимости. Получающиеся ампликоны клонируют в плазмидный вектор и анализируют при помощи дифференциальной гибридизации (Рис. 1.3.1). Зондами для гибридизации служат те же ампликоны фланков геномных повторов, но полученные с использованием других супрессионных адапторов. Например, при поиске повторов, специфичных для генома человека, ДНК клонов, несущих вставки амплифицированных фланков повторов человека наносят на фильтр, а гибридизуют их с меченными ампликонами фланков человека и шимпанзе. Эти последние ампликоны получают с использованием других супрессионных адапторов - для того, чтобы одинаковые адапторные последовательности не вызывали «неспецифической» кросс-гибридизации клонов и зонда. Дифференциально гибридизующиеся клоны секвенируют и каким-либо независимым способом проверяют, действительно ли они уникальны для того или иного генома (например, при помощи локус-специфической ПЦР, как описано в прошлом разделе).
Рисунок 1.3.1. Схема метода DiffIR. Приложение метода включало в себя фрагментацию геномной ДНК человека и шимпанзе, лигирование супрессионных адапторов (стадия 1), селективную амплификацию, включающую nested ПЦР с праймерами, специфичными для повтора (Т1 и Т2 на рисунке), а также для адаптора (А1 и А2) - стадии 2, 3. Полученный ампликон клонируют в плазмидный вектор, клоны библиотеки переносят на фильтр и гибридизуют с меченными зондами, которые представляют собой аналогичным образом полученные ампликоны (но с использованием других супрессионных адапторов) из сравниваемых геномов (стадия 4). Дифференциальные клоны анализируют.
В модельном эксперименте искали уникальные для человека внедрения эндогенных ретровирусов HERV-K (HML-2). На фильтр наносили ампликон фланков человека и гибридизовали его с зондами на фланки человека и шимпанзе (рис. 1.3.2). Дифференциальные клоны секвенировали и анализировали.
При гибридизации сложность смеси была невысока: количество повторов данного типа в геноме человека оценивается как ~2000, и сложность составляла 250 (средний размер фрагментов, получаемых при рестрикции AluI) Ч 2000 = 5 Ч 105, что в среднем соответствует всего 10% сложности бактериального генома. Таким образом, кинетические параметры гибридизации благоприятствовали успеху. Для того, чтобы провести скрининг 95% из упомянутых 2000 последовательностей, необходимо проанализировать около 6000 клонов библиотеки, что представляется более чем посильной задачей для современного уровня техники геномных исследований. В ходе модельного эксперимента была проанализирована лишь небольшая часть библиотеки. При этом отсеквенировали 40 как дифференциальных, так и недифференциальных клонов. Все они содержали ожидаемые фрагменты адапторов и действительно являлись фланками эндогенных ретровирусов исследуемого семейства. Таким образом, эффективность селективной амплификации, как и в случае TGDA, близка к 100%.
Рисунок 1.3.2. Пример дифференциальной гибридизации с зондами на фланки ЭРВ человека и шимпанзе, меченными 32P. Справа приведены примеры локус-специфической ПЦР дифференциальных клонов (см. выше в тексте).
22 из отсеквенированных 40 клонов были дифференциальными и гибридизовались с зондами на фланки ЭРВ человека, но не шимпанзе. Локус-специфическая ПЦР показала, что 16 из этих 22 клонов действительно соответствовали человек-специфичным ЭРВ. Таким образом, специфичность дифференциальной гибридизации была оценена как 73%. Наличие ложно-дифференциальных клонов (6 из 22) может быть связано с появлением или исчезновением рестриктных сайтов в одном из сравниваемых геномов (для фрагментации геномной ДНК используются рестриктазы) и, соответственно, с артефактной недопредставленностью некоторых локусов в анализируемых ампликонах.
Очевидное преимущество метода - как и для TGDA, возможность анализа геномных повторов независимо от геномных баз данных.
По материалам работы была опубликована статья:
Mamedov, I., Batrak, A., Buzdin, A., Arzumanyan, E., Lebedev, Y., Sverdlov, E. (2002) Genome-wide comparison of differences in the integration sites of interspersed repeats between closely related genomes. Nucleic Acids Res., 30(14):e71.
1.4 Приложение методов TGDA и Diffir для молекулярной генетики человека
Если технические аспекты разработанных экспериментальных подходов были освещены выше, то в данном разделе будут рассмотрены приложения полученных таким образом данных для детального анализа чс ретроэлементов семейств L1 и HERV-K(HML-2). Работа выполнялась коллективом авторов, включавшим С. В. Устюгову, Е.В. Гогвадзе, К. В. Ходосевича, Ю. Б. Лебедева, Е.А. Ковальскую и А. А. Буздина, при деятельном участии акад. Е.Д.Свердлова. Автор диссертации делал экспериментальную работу и биоинформатический анализ данных, осуществлял непосредственное руководство продвижением исследований, а также выдвинул идею механизма образования химерных ретроэлементов. Химерные ретроэлементы грибов исследовались в сотрудничестве с Марк-Анри Лебраном и Кристель Барбизан из совместной лаборатории CNRS u фирмы Bayer (Лион, Франция).
1.4.1 Идентификация человек-специфичных инсерций эндогенных ретровирусов
Структурный анализ известных чс LTR. Проанализировав 23 последовательности человек-специфичных LTR, найденные нами, а также 18 чс LTR, найденные другими авторами (всего 41 последовательность), мы обратили внимание, что все они, за исключением одного LTR, обладают значительной структурной гомологией и формируют один кластер на филогенетическом древе. Значения внутригрупповой дивергенции варьировали от 0.1 до 3.5% со средним значением 2.3%. Один чс LTR (AC022567) сильно отличался от остальных 40 LTR (средняя дивергенция 6%) и поэтому не мог быть отнесён к той же группе. В соответствии с классификацией, опубликованной в (258), этот LTR принадлежит к группе II-T.
Основываясь на 40 последовательностях высоко гомологичных чс LTR, мы создали консенсусную последовательность (HS консенсус) для эволюционно молодого семейства HS (Рис. 1.4.1). Эта последовательность содержит 9 характеристических нуклеотидных позиций.
1 31 61
cons_HS TGTGGGGAAAAGCAAGAGAGATCAGATTGT TACTTGTTCTGTGTAGAAAGAAGTAGACAT AGGAGACTCCATTTTGTTATGTACTAAGAA
cons_HS-a .............................. .............................. ..............................
cons_HS-b .............................. .............................. ..................S...........
cons_II-N ****************************** ****************************** ******************************
cons_II-T .............................. .............................. ..............................
cons_II-V ............A................. .............................. ..............................
cons_II-B ****************************** ****************************** ******************************
cons_II-O ............A................. .............................. ..............................
91 121 151 +
cons_HS AAATTCTTCTGCCTTGAGATTCTGTTAATC TATAACCTTACCCCCAACCCCGTGCTCTCT GAAACRTGTGCTGTGTCAA-CTCAGAGTTR