7.3 Ужесточение требований к селекции совершенных дуплексов
Данная стратегия направлена не на улучшение условий гибридизации, а на более эффективный селективный отбор совершенных дуплексов и на отбрасывание химерных гибридов (Рис. 7.1). Для этого можно использовать химические модификации неспаренных нуклеотидов (см. выше) или же специфичные к несовершенным дуплексам нуклеазы (подробно рассмотрено в Главе 6). Например, подход, названный mispaired DNA rejection (MDR), относительно недавно опубликованный Чалой и соавторами (77), позволяет практически полностью исключить химерные последовательности из гибридизационных библиотек даже большой сложности. При этом используются два фермента: узнающая единичные неспаренные нуклеотиды эндонуклеаза Surveyor, а также специфичная для участков одноцепочечной ДНК (и, соответственно, для петлевых участков несовершенных дуплексов) нуклеаза Mung Bean.
На основе данного обзора литературы были опубликованы следующие материалы:
1) Монография “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Редакторы: Anton Buzdin и Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.
2) Nucleic acids hybridization: potentials and limitations (Anton Buzdin) глава в книге “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Editors: Anton Buzdin and Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.
3) Selective suppression of polymerase chain reaction and its most popular applications (Sergey Lukyanov, Nadezhda Gurskaya, Ekaterina Bogdanova, Anton Buzdin). глава в книге “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Editors: Anton Buzdin and Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.
4) Suppression subtractive hybridization (Sergey Lukyanov, Denis Rebrikov, Anton Buzdin). глава в книге “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Editors: Anton Buzdin and Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.
5) Stem-loop oligonucleotides as hybridization probes and their practical use in molecular biology and biomedicine (Anton Buzdin, Sergey Lukyanov). глава в книге “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Editors: Anton Buzdin and Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.
6) Coincidence cloning: robust technique for isolation of common sequences (Anton Buzdin). глава в книге “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Editors: Anton Buzdin and Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.
7) DNA hybridization in solution for mutation detection (Anton Buzdin) глава в книге “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Editors: Anton Buzdin and Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.
8) Current attempts to improve the specificity of nucleic acids hybridization (Anton Buzdin). глава в книге “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Editors: Anton Buzdin and Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.
Экспериментальная часть работы
1. Методы идентификации новых копий геномных повторов
1.1 Введение
Выход молекулярной генетики на качественно новый уровень - уровень исследования и сопоставления структуры и функций целых геномов - возможен лишь при прогрессивном развитии арсенала соответствующих экспериментальных подходов. Первым этапом могло бы являться получение исчерпывающих структурных данных, вторым - расшифровка на их основе функциональной роли тех либо иных участков генома. Возможно, наилучшим из имеющихся подходов с точки зрения полноты охвата проблемы является тотальное секвенирование геномной ДНК и библиотек транскриптов различных тканей исследуемого организма. Вместе с тем, регуляторные участки генома таким способом выявить невозможно. Кроме того, подход очень дорог и требует огромного напряжения усилий множества учёных.
Применение технологии микрочипов не может быть полноценной заменой полного секвенирования, так как не позволяет различать слабодивергировавших представителей мультигенных семейств, а также те последовательности, в состав которых входят повторяющиеся элементы. Кстати, наличие большого количества повторяющихся последовательностей в определённых локусах создаёт проблемы и для определения полной структуры генома методом тотального секвенирования - так, последовательности теломерных и центромерных районов хромосом принципиально не могут быть получены при использовании имеющегося инструментария.
Одной из целей настоящей работы являлась разработка экспериментальных подходов, позволяющих проводить полногеномное сравнение распределения геномных повторов в ДНК представителей разных видов или между различными особями одного вида. Изменения в структуре ДНК, прямо или косвенно связанные с изменением количества копий геномных повторов, являются одним из важнейших факторов эволюции геномов и, соответственно, видообразования.
Помимо понимания многих аспектов эволюции, изучение геномных повторов, в особенности - мобильных элементов генома и их фракции, активной у позвоночных, ретроэлементов - может дать исследователям новые полиморфные маркёры, которые могут быть использованы как для филогенетических, так и для медико- и популяционно-генетических исследований. Такие маркёры, созданные на основе ретроэлементов, обладают рядом преимуществ относительно остальных типов полиморфных маркёров: (1) они относительно стабильны, (2) возможность нескольких независимых внедрений ретроэлементов в один и тот же сайт генома пренебрежимо мала, (3) известно “предковое” состояние геномного локуса - отсутствие ретроэлемента, поэтому можно определять степень родства между различными анализируемыми организмами и, наконец, (4) наличие либо отсутствие ретроэлемента в исследуемом локусе можно быстро и надёжно установить с помощью ПЦР.
Ретроэлементы обладают значительным регуляторным потенциалом, обеспечивающим контроль экспрессии их собственных генов. В то же время, известно, что активность многих уникальных функциональных участков генома, например, многих генов, модулируется располагающимися по соседству вставками ретроэлементов. Поэтому сравнение распределения ретроэлементов между геномами представляется одной из важнейших задач молекулярной генетики. Применяемые для решения этой задачи большинством исследователей экспериментальные подходы не обладают полнотой анализа. Казалось бы, наилучшим выходом могла бы стать тотальная идентификация геномных повторов в базах данных. Однако же этот подход имеет один крупный недостаток. Вся информация о наличии повторов в различных локусах генома берётся из баз данных и, учитывая, что для всех крупных проектов секвенируют ДНК лишь небольшого количества представителей исследуемого вида, подавляющее большинство аллелей теряется. Кроме того, прицентромерные и прителомерные участки с трудом поддаются анализу и недопредставлены во всех опубликованных последовательностях ДНК эукариот со сложным геномом. Таким образом, базы данных содержат неполную информацию. К тому же, таким способом можно исследовать только те объекты, геномная последовательность которых частично или же почти полностью установлена.
Поэтому актуальной представляется задача создания экспериментальных методов, позволяющих проводить полногеномное сравнение распределения повторяющихся элементов между организмами независимо от информации, содержащейся в базах данных. Далее будут рассмотрены два таких подхода, разработанные в нашей группе. Оба метода были успешно опробованы для поиска ретроэлементов, специфичных для ДНК человека.
1.2 Метод TGDA: вычитающая гибридизация участков, фланкирующих геномные повторы
В рабочей группе, включавшей Ю. Б. Лебедева, С. В. Устюгову, К. В. Ходосевича, И. З. Мамедова и А. А. Буздина, был разработан метод, названный TGDA (от англ. Targeted Genomic Differences Analysis), позволяющий проводить полногеномный сравнительный анализ геномных повторов в ДНК изучаемых организмов. Принципиальная идея метода принадлежит акад. Е. Д. Свердлову, автором рабочей версии метода и большинства его модификаций является автор настоящей работы.
Принцип метода. TGDA состоит из трёх основных стадий (cм. Рис. 1.2.1):
(1) Селективная амплификация последовательностей ДНК, фланкирующих повторяющиеся элементы в сравниваемых геномах, с использованием эффекта “ПЦР-супрессии”(97).
(2) Обработка полученных ампликонов экзонуклеазой ExoIII для получения 5'-выступающих концов (эта стадия критична для всего процесса; она призвана убрать из ампликонов, полученных после (1) стадии, остающиеся в них последовательности мобильных элементов.
(3) Основанная на ПЦР вычитающая гибридизация (ВГ) обработанных ампликонов.
Для вычитания один из ампликонов (так называемый драйвер, англ. driver) берётся в значительном избытке над другим, называемым трейсер, англ. tracer. ВГ (подробно описана в литературном обзоре) позволяет напрямую идентифицировать последовательности (назовём их мишени), присутствующие в трейсере, но отсутствующие в драйвере.
Остановимся на перечисленных трёх стадиях поподробнее.
Первая (1) стадия (Рис. 1.2.1.А), базирующаяся на использовании эффекта ПЦР-супрессии, включает в себя (i) фрагментацию геномной ДНК частощепящей (узнающей 4-нуклеотидные последовательности) рестриктазой; например, мы использовали фермент AluI. (ii) К полученным рестриктным фрагментам лигируются олигонуклеотидные адапторы, формирующие сковородоподобные структуры (Рис. 1.2.1.А, стадия 2; структуры олигонуклеотидов A1A2 и a1 приведены в разделе «Материалы и методы» соответствующей публикации (19).
Рисунок 1.2.1. Схема метода TGDA. (А) Селективная амплификация фланков мобильных элементов (обозначены как Тр) сравниваемых геномов. (Б) Вычитающая гибридизация полученных ампликонов
Использовались стандартные адапторы, образующие после лигирования одноцепочечные (оц) 5'-выступающие концы, по которым ДНК-полимераза достраивала 3'-концы. В результате, все рестриктные фрагменты ДНК оказывались фланкированы инвертированными повторами. Таким образом, при денатурации, образующиеся оц фрагменты содержат взаимно комплементарные последовательности, образующие мощные внутримолекулярные шпилечные (или сковородоподобные) структуры (Рис. 1.2.1.А).
ПЦР-амплификация фрагментов ДНК, содержащих такие внутримолекулярные структуры, супрессируется, если используются только праймеры, комплементарные лигированным адапторам (Рис. 3.2.1.А, стадия 2).
Если же такие праймеры используются в паре с праймерами, комплементарными внутренней (одноцепочечной) части сковородоподобной структуры, ПЦР проходит нормально (Рис. 1.2.1.А, стадия 2). Амплифицированная ДНК в этом случае будет иметь различающиеся концевые последовательности, не образующие внутримолекулярных структур, и может быть далее успешно амплифицирована с праймерами A1+T1 (iii). Этап “Nested” ПЦР с праймерами А2 и Т2 призван повысить специфичность амплификации. При правильном выборе праймеров процедура позволяет обеспечить амплификацию только лишь тех фрагментов, которые содержат последовательность интересующего мобильного элемента.
На второй (2) стадии, перед обработкой ExoIII, c помощью ре-амплификации полученных на предыдущей стадии ампликонов, готовят две отдельные фракции ДНК трейсера (Рис. 1.2.1.Б, слева, стадия 1). Для этого используется “step-out” вариант ПЦР (257) с праймерами А1А2, А1 и Т2, либо же А1Т2, А1 и А2 для амплификации фракций А и Б, соответственно. Получившиеся фрагменты ДНК фракции А содержат последовательность А1А2 на одном конце и Т2 - на другом, а у фрагментов фракции Б на концах содержатся последовательности А2 и А1Т2.
Затем полученные ампликоны обрабатывают экзонуклеазой ExoIII. Эта стадия получения оц 5'-концов (Рис. 1.2.1.Б, стадия 2) является критической для всего процесса: она предотвращает кросс-гибридизацию повторяющихся частей, общих для всех ампликонов, и обеспечивает последующую специфическую амплификацию двухцепочечных гетеродуплексов ТрейсерА/ТрейсерБ, образующихся в процессе ВГ. Для формирования оц 5'-выступающих концов, ампликоны (как трейсера, так и драйвера) обрабатывают ExoIII из рассчёта, что фермент удаляет ~6,7 3'-концевых нуклеотидов в минуту.
На последней (3) стадии трейсеры А и Б смешивают со 100- или 200- кратным избытком драйвера (Рис. 1.2.1.Б, стадия 3), денатурируют и оставляют гибридизоваться на 14 часов. Получившаяся в результате смесь содержит оц фрагменты трейсера и драйвера, двуцепочечные гибриды трейсера и драйвера, гомодуплексы, получившиеся при само-реассоциации драйвера и трейсеров А и Б, и гетеродуплексы, сформированные при кросс-реассоциации комплементарных цепей трейсеров А и Б (фракция ТрейсерА/ТрейсерБ).
После того, как выступающие оц концы последних упомянутых гетеродуплексов заполнены ДНК-полимеразой, эти гетеродуплексы получают сайт посадки праймера А1 с обоих флангов и становятся единственными фрагментами, которые могут быть экспоненциально ПЦР-амплифицированы, если в смеси присутствует только один этот праймер. Продукты последующей ПЦР клонируют в E. coli и далее анализируют вставки. Прохождение самой ВГ может быть описано формулой (цитируется по работе Е. Свердлова и О. Ермолаевой (53)):
Ed(t)=(1+RD0 t)/(1+RT0 t), где Ed(t) - это значение ожидаемого обогащения вычтенной ДНК дифференциальными последовательностями, R [M-1сек-1] - константа скорости реассоциации. D0 и T0 - исходные молярные концентрации драйвера и трейсера, соответственно. Максимальным обогащением при t®Ґ является соотношение концентраций трейсера и драйвера D0 /T0. Для ограниченных значений времени, таких как 14 часов, обогащение должно быть тем больше, чем больше RD0. Таким образом, для получения наилучших показателей обогащения следует повышать значения R или D0, либо обе эти величины.
Мы применили TGDA для поиска последовательностей мобильных элементов, специфичных для генома человека. Такими мобильными элементами являются те, которые интегрировали в геном представителей предковой линии человека уже после расхождения её с предковой линией ближайшего родственника H. sapiens - шимпанзе. Сейчас известны 5 таких семейств мобильных элементов, все они относятся к ретроэлементам. Это некоторые представители эндогенных ретровирусов HERV-K (HML-2), LINE L1 и ретропозонов Alu, SINE-R и SVA. Идентификация специфичных для генома человека (чс) внедрений таких ретроэлементов является важной задачей генетики H. sapiens, мы же таким образом ещё и проверяли возможности техники TGDA, тем самым одновременно “убивая двух зайцев”. Для проведения экспериментов мы выбрали два семейства ретротранспозонов: HERV-K (HML-2) и L1, которые, в отличие от остальных трёх семейств, обладают гораздо более сложной структурой и большим спектром воздействия на функционирование генома.
Большинство геномных копий HERV-K (HML-2) в ходе эволюции претерпели гомологичную рекомбинацию по последовательностям своих длинных концевых повторов (LTR), и теперь существуют в виде одиночных LTR. Поэтому праймеры, выбранные для специфической амплификации HERV-K-фланкирующих областей, были подобраны именно на консервативные последовательности LTR этих эндогенных ретровирусов. Проводили амплификацию последовательностей, фланкирующих LTR с 5'-конца, поэтому оба LTR-специфичных праймера (обозначены на Рис. 1.2.1 как Т1 и Т2) имеют обратную ориентацию относительно последовательности LTR.