Диссертация: Полногеномные подходы к функциональному анализу повторяющихся элементов

cons_HS-a .............................. .............................. ...................-..........

cons_HS-b .............................. .............................. ...................-..........

cons_II-N **.....................A....C. ...G.......................... ...................A.....G...A

cons_II-T ....................K......... ...G.......................... ...................A.....G...A

cons_II-V ....................K......... ...G.......................... .................C.-.....G...A

cons_II-B **............................ ...G.......................... ...................-.....G...A

cons_II-O ....................G......... .G.....C...................C.. ..G................-.....G...A

181 211 241

cons_HS AATGGATTAAGGGCGGTGCAAGATGTGCTT TGTTAAACAGATGCTTGAAGGCAGCATGCT CCTTAAGAGTCATCACCACTCCCTAATCTC

cons_HS-a ....................R......... .............................. ..............................

cons_HS-b ....................A......... .............................. ..............................

cons_II-N .............TT......A........ .............................. ..............................

cons_II-T .............................. .............................. ..............................

cons_II-V ..............K............... .............................. ..............................

cons_II-B ..............T............... .............................. ..............................

cons_II-O ..............K.....R......... .............................. ..............................

271 + 301 331

cons_HS AAGTACCCAGGGACACAAA-AACTGCGGAA GGCCGCAGGGACCTCTGCCTAGGAAAGCCA GGTATTGTCCAAGGTTTCTCCCCATGTGAT

cons_HS-a ...................-.......... .............................. ..............................

cons_HS-b ...................-.......... .............................. ..............................

cons_II-N ...................-C......... .............................. ..............................

cons_II-T ...................-C......... .............................. ..............................

cons_II-V ...................-C......... .............................. ..........R...................

cons_II-B ...................-C......... .............................. ..............................

cons_II-O ...................AC......... .............................. ..............................

361 391 421

cons_HS AGTCTGAAATATGGCCTCGTGGGAAGGGAA AGACCTGACCRTCCCCCAGCCCGACACCCG TAAAGGGTCTGTGCTGAGGAGGATTAGTAA

cons_HS-a .............................. ..........G................... ..............................

cons_HS-b .............................. ..........R................... ..............................

cons_II-N ..................T........... ..........G................... .............................T

cons_II-T .............................. ..........G................... .............................T

cons_II-V .............................. ..........G................... .............................W

cons_II-B .............................. ..........G................... ..............................

cons_II-O .............................. ..........G................... ..............................

451 481 511

cons_HS AAGAGGAAGGAATGCCTCTTGCAGTTGAGA CAAGAGGAAGGCATCTGTCTCCTGCCTGTC CCTGGGCAATGGAATGTCTCGGTATAAAAC

cons_HS-a .............................. .............................. ..............................

cons_HS-b .............................. ..........................C... ..............................

cons_II-N ..........C................... ...........................A.. ....................C.........

cons_II-T ..........C................... .............................. ..............................

cons_II-V ..........C................... .............................. ..............................

cons_II-B ..........CC.--..-............ T........................T.... .......................G......

cons_II-O ............C................. .............................. .......................G......

+

541 + 571 601

cons_HS CCGATTGTATGCTCCATCTACTGAGATAGG GAAAAACCGCCTTAGGGCTGGAGGTGGGAC CTGCGGGCAGCAATACTGCTTTGTAAAGCA

cons_HS-a .............................. .............................. ..............................

cons_HS-b .............................. .............................. ..............................

cons_II-N .........C.T.................. .G..............C.........A... A.............................

cons_II-T .........C.T.................. .............................. A.............................

cons_II-V ...........T.................. .G............................ A.........................G...

cons_II-B ...........T.................. AG........................A... A...K...............Y.T...T...

cons_II-O ...........T.................. .G............................ A...................C.T...G...

631 661 + 691

cons_HS TTGAGATGTTTATGTGTATGCATATCTAAA AGCACAGCACTTAATCCTTTACATTGTCTA TGATGCAAAGACCTTTGTTCACGTGTTTGT

cons_HS-a .............................. .............................. ..............................

cons_HS-b .............................. .............................. ..............................

cons_II-N .............................. ............G..T.....TC....... .......G......................

cons_II-T .............................. ............R.........C....... ..............................

cons_II-V .......R...................... -..............T......C....S.R .......G..............S.....A.

cons_II-B ......................Y....... ...............T......C....... .......G....................A.

cons_II-O ............C......ATG........ -..............T......C....T.. .......G....................AC

721 + 751 + 781

cons_HS CTGCTGACCCTCTCCCCACAATTGTCTTGT GACCCTGACACATCCCCCTCTTCGAGAA-A CACCCACRRATGATCAATAAATACTAAGGG

cons_HS-a .............................. ............................-. .......AG.....................

cons_HS-b .............................. ............................-. .......G......................

cons_II-N T..................T.......... .....................CA.....-. ..............................

cons_II-T ...................T.......... .....................CG.....-. .......G......................

cons_II-V S........TY...T....T...A..Y.A. .....................C......-. ......AG......................

cons_II-B ..............T....T...A....A. ...................T.C......-. ......AGG.....................

cons_II-O .........T....T....T...A..C.A. .......C.............C......C. ......AT......................

811 841 871

cons_HS AACTCAGAGGCTGGCGGGATCCTCCATATG CTGAACGCTGGTTCCCCGGGTCCCCTTATT TCTTTCTCTATACTTTGTCTCTGTGTCTTT

cons_HS-a .............................. .............................. ..............................

cons_HS-b .............................. .............................. ..............................

cons_II-N ................A............. ................T..C********** ******************************

cons_II-T .............................. ....................C......... ..............................

cons_II-V ...........C.............R.... ....................********** ******************************

cons_II-B ...........C.............G.... .............................. ..............................

cons_II-O ...........C.............G.... ........C...C...T...C...T..T.. ............................C.

901 931 961 + 971

cons_HS TTCTTTTCCAAATCTCTCGTCCCACCTTAC GAGAAACACCCACAGGTGTGTAGGGGCAAC CCACCCCTACA

cons_HS-a .............................. .............................. ...........

cons_HS-b ......C.T..G........T......... ....................G......... ...........

cons_II-N ****************************** ****************************** ***********

cons_II-T ...........G........T......W.. ....................G......... ........T..

cons_II-V ........T..G......C.T......A.. ....................G......... ........T..

cons_II-B ****************************** ****************************** ***********

cons_II-O ...........G......A.T......A.. ....................G......... ........T..

Рисунок 1.4.1. Структурное выравнивание консенсусных последовательностей семейств LTR HS, HS-a, и HS-b с консенсусными последовательностями других относительно эволюционно молодых групп LTR HERV-K (HML-2). Диагностические позиции, специфичные для групп HS, затемнены и обозначены "+" (Позиции 176, 291, 553, 601, 683, 740, 772 и 969). Нуклеотидные замены, различающие группы HS-a и HS-b выделены жирным шрифтом и помечены стрелками. (*) обозначают отсутствие структурных данных. Для обозначения нуклеотидов была применена номенклатура IUPAC-IUB: R- A, G; Y- C, T; K- G, T; S- C, G; W- A, T.

Проведённый с помощью программы BLAST поиск выявил в геномных базах данных 273 полноразмерные (длиной ~970 пн) последовательности, от 100 дo 97% идентичные HS консенсусу. Мы выбрали этот диапозон идентичности, поскольку степень взаимной гомологии среди 40 LTR, использованных для создания консенсуса, варьировала от 99.8 дo 97.6% со средним значением 98.1%.

После того, как дублирующие друг друга контиги были отброшены, количество индивидуальных последовательностей LTR семейства HS составило 142 (Приведены в Табл. 1 раздела Supplementary Material на web сайте http://humgen.siobc.ras.ru). Единственный чс LTR из контига AC022567, который не мог быть отнесён к семейству HS (см. выше), не имел высокогомологичных (более 97%) последовательностей в геномных базах данных.

Для того, чтобы найти частоты встречаемости характеристических нуклеотидных позиций HS консенсуса во всех членах HS семейства, а также в LTR, не являющихся членами группы HS, мы сделали множественное выравнивание найденных в этой работе 142 HS и 89 известных не-HS LTR, опубликованных в статьях (258-263) (выравнивание помещено в разделе Supplementary Material на сайте http://humgen.siobc.ras.ru). Результаты чётко показывают, что 8 диагностических позиций консенсусной последовательности являются уникальными характеристиками семейства HS (Taбл. 1.4.1).

Таблица 1.4.1. Частота встречаемости диагностических нуклеотидных позиций консенсуса семейства HS в чс и не-чс LTR HERV-K (HML-2) .

a Диагностические нуклеотидные позиции консенсусной последовательности HS. Частоты встречаемости: б в известных 40 человек-специфичных LTR, в в 141 LTR семейства HS, г в 82 известных не человек-специфичных LTR HERV-K.

Разделение семейства HS на два подсемейства. Средняя внутригрупповая дивергенция LTR семейства HS, составляющая 2.3%, соответствует эволюционному возрасту группы в 8.7 миллионов лет, принимая значение скорости мутирования LTR 0.13% за миллион лет (264). Дальнейший анализ последовательностей представителей семейства HS позволил выделить в его составе два подсемейства, названные нами HS-a и HS-b, представленные, соответственно, 63% и 37% последовательностями LTR.

Подсемейство HS-a высоко гомологично консенсусной последовательности HS и характеризуется внутригрупповой дивергенцией 1.5%, что соответствует возрасту 5.8 миллионов лет. Все LTR семейства HS-a, для которых это известно, являются специфичными для генома человека.

Представители подсемейства HS-b несут 5 характеристических сцепленных однонуклеотидных замен в положениях 907, 909, 912, 921 и 950 консенсусной последовательности HS (см. Рис. 1.4.1).

Подсемейство HS-b эволюционно старше чем HS-a, для него значение внутригрупповой дивергенции составляет 2.6%, соответственно, возраст 10.3 миллиона лет. По крайней мере 3 члена подсемейства HS-b не являются человек-специфичными, а присутствуют также в геноме шимпанзе.

Интересно, что 86% всех провирусов HERV-K (HML-2), несущих HS LTR, обладают длинными концевыми повторами подсемейства HS-a, и только 14% провирусов содержат LTR HS-b. Следовательно, 13% из 89 представителей эволюционно более молодого подсемейства HS-a включено в состав провирусов, против всего 4% из членов более старой группы HS-b. Это может рассматриваться как пример временной инактивации эволюционно более старой группы эндогенных ретровирусов.

Эволюционная история семейства HS. Пик ретропозиционной активности этого семейства пришёлся на период после разделения предковых линий человека и шимпанзе, которое произошло, по разным оценкам, 4 - 6 миллионов лет назад. Примерно 90% представителей семейства HS специфичны для генома человека. Некоторые из них полиморфны в современной человеческой популяции (261, 263, 265), это свидетельствует о том, что члены HS семейства оставались транспозиционно активны вплоть до самого недавнего времени в эволюционной истории вида Homo sapiens, оставаясь, возможно, активными и поныне.

По всей вероятности, материнские последовательности HS семейства возникли в геноме общего предка линий гориллы, шимпанзе и человека около 10.7 миллионов лет назад, дав группу HS-b. Эта группа, оставаясь активной, 5.8 миллионов лет назад, то есть примерно во время расхождения предковых линий человека и шимпанзе, в свою очередь, дала начало более ретропозиционно активной группе HS-a, которая на настоящий момент составляет большую часть (63%) всего семейства HS. Интересно, что 5 сцепленных нуклеотидных замен, различающих группы HS-a и HS-b, лежат в регионе, ранее охарактеризованном как цис-негативный регулятор промоторной активности одного из LTR семейства HS-b (код доступа в GenBank L47334). Делеция 70 пар нуклеотидов из этого региона в 2 раза повысила промотерную активность соответствующего LTR (266). Более высокие темпы ретропозиции более эволюционно молодой группы HS-a могут являться следствием этих 5 мутаций в регионе негативного регулятора LTR.

Также интересно, что группа HS-b оставалась активной после расхождения линий предков человека и шимпанзе как в линии человека, так и в линии шимпанзе. Представители обеих групп HS-a и HS-b были ретропозиционно активны вплоть до относительно недавнего времени в эволюции человека. Это следует из трёх найденных на время проведения исследования примеров LTR, полиморфных в человеческой популяции: два представителя HS-a в составе провирусов HERV-K (HML-2) 113 (AY037928) и HERV-K (HML-2) 115 (AY037929) (251), и один одиночный LTR семейства HS-b (Z80898) (251).

Идентификация одного чс LTR, принадлежащего к семейству II-T, а не

HS (см. выше) свидетельствует о том, что по крайней мере три мастер-гена LTR HERV-K (HML-2), а именно HS-a, HS-b и II-T, были активны в эволюционной линии гоминид. Интеграции LTR вблизи генов или в даже в интронах генов могли существенно повлиять на их экспрессию. В свою очередь, изменения в экспрессии некоторых генов, особенно кодирующих регуляторные белки, могли повлиять на развитие эмбриона и, тем самым, принять участие в видообразовании человека.