Структура использованных супрессионных адапторов: A1A2, 5'-TGTAGCGTGAAGACGACAGAAAGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3'; a1, 5'-ACCGCCCTCCG-3'; A1, 5'-TGTAGCGTGAAGACGACAGAA-3'; A2, 5'-AGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3'.
Структура LTR-специфичных праймеров, использованных для селективной амплификации: Т1, 5'-gggctgggggacggtcaggt-3'; T2, 5'- gacacagtaac(a/g)gtctgatctc-3'; T3, 5'- ccagcccgacacccgtaaa-3'.
Структура L1-специфичных праймеров, использованных для селективной амплификации: T1, 5'-TTAGTGGGTGCAGCGCACCAG-3'; T2, 5'-CATATGTAACTAACCTGCACAATGT-3'.
1 нг аликвоты ампликонов человека амплифицировались в соответствии с процедурой `step-out PCR' с двумя наборами праймеров: A (0.01 мM A1A2, 0.2 мM A2, 0.2 мM T2) или с набором B (0.01 мM A2T2, 0.2 мM A2, 0.2 мM A1), программа ПЦР: 15 циклов х (95oC -15'', 57oC - 10'', 72oC - 1`30''). Полученные образцы Трейсеров А и Б (по 150 нг в случае фланков как LTR, так и L1), а также образцы Драйвера (начальный ампликон ДНК шимпанзе, 3000 нг для фланков LTR и 4600 нг для фланков L1) обрабатывались нуклеазой ExoIII (Promega, США) по отдельности при 16oC в следующих условиях: фланки LTR, Трейсер А - 20 единиц ExoIII,10 минут (удаление 40 концевых нуклеотидов); Трейсер Б - 20 единиц, 12 минут (удаление 60 нуклеотидов); Драйвер, 400 единиц, 10 минут (удаление 40 нуклеотидов); фланки L1, Трейсер А - 20 единиц ExoIII,12 минут (удаление 60 концевых нуклеотидов); Трейсер Б - 20 единиц, 15 минут (удаление 80 нуклеотидов); Драйвер, 500 единиц, 12 минут (удаление 60 нуклеотидов).
В случае фланков LTR смешали по отдельности по 15 нг обработанных нуклеазой Трейсеров А и Б с 1500 нг обработанного Драйвера. В случае фланков L1 смешали отдельно по 12 нг обоих Трейсеров с 2300 нг Драйвера. Полученные образцы ДНК очистили дробной экстракцией фенолом и хлороформом, переосадили этанолом и растворили в 5 мкл (в первом случае) и в 1 мкл (во втором случае) гибридизационного буфера (0.5 M NaCl/50 mM Hepes, pH 8.3/0.2 mM EDTA).
4.4 Вычитающая гибридизация
Образцы Трейсер А/Драйвер и Трейсер Б/Драйвер смешали, денатурировали ДНК 10 минут при 95oC и гибридизовали 14 часов при 65oC. Конечную гибридизационную смесь разбавили буфером pH 8.3, содержащим 50mM NaCl/5mM Hepes, 0.2mM EDTA. 1 мкл разбавленной смеси ПЦР-амплифицировали с 0.4 мM праймером A1 при условиях: 1) 72oC в течение 6 минут для заполнения концов образовавшихся ДНК; 2) (95oC -15'', 65oC - 10'', 72oC - 1`30''), х15 циклов.
4.5 Создание библиотек и дифференциальный скрининг фланков повторяющихся элементов
Продукты ВГ были клонированы в E. coli штамма DH5б с использованием набора реактивов “TA-cloning system” (Promega). По 480 индивидуальных клонов из библиотек фланков LTR и L1 были упорядочены в 96-луночные плашки.
Дифференциальный скрининг проводился только для библиотеки фланков LTR. ДНК вставок клонов упорядоченной библиотеки амплифицировали с праймером А1 и параллельно наносили на два набора нейлоновых мембран Hybond N (Amersham, США). Мембраны гибридизовали с ампликонами фланкирующих последовательностей человека и шимпанзе, радиоактивно помеченных 32P с использованием “Prime-a-Gene labeling system” (Promega) при 68oC в соответствии со стандартным протоколом.
4.6 Определение первичной структуры клонов
Определение последовательности ДНК проводили с помощью автоматического секвенатора ДНК Applied Biosystems 373 automatic DNA sequencer либо при помощи Центра Коллективного Пользования «Геном».
4.7 Анализ последовательностей ДНК
Поиск гомологий в базах данных GenBank проводился с помощью сервера BLAST at NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST), картирование последовательностей в геноме человека и анализ генного окружения проводили, используя программное обеспечение UCSC Human Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/goldenPath/hgTracks.html). Поиск копий U6 мяРНК и псевдогенов 5S рРНК, 4,5S рРНК, различных тРНК, белков L7, L7A, L23A, L10, L31, L28, 7SK, 7SL, малых ядрышковых РНК Е1, Е2, Е3, малых РНК hY1, CYCLO, псевдогенов XBR, XTR, малых ядерных РНК U1, U2, U3, U4, U5 в геноме человека осуществляли с использованием сервера BLAT (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBLAT). Идентификацию геномных повторов в исследуемых последовательностях проводили при помощи программы RepeatMasker (http://ftp.genome.washington.edu/cgi-bin/RepeatMasker; A.F.A. Smit & P. Green, неопубликованные данные). Консенсусные последовательности повторяющихся элементов генома человека брали из базы данных RepBase Update (http://www.girinst.org/server/RepBase/). Выравнивание последовательностей проводили с помощью программ ClustalW (335) и ClustalWin (автор Т. Городенцева, ЛСФГЧ, ИБХ РАН). Филогенетический анализ и построение деревьев автор осуществлял с использованием программ Vector NTI, DnaDist, DnaPars и Fitch пакета PHYLIP (336). Визуализация деревьев проводилась с помощью программы TreeView. Также автором использовалась программа GeneRunner для подбора необходимых праймеров.
4.8 ПЦР-анализ
Амплифицировали 40 нг матрицы, в качестве которой выступали геномные ДНК, с использованием уникальных геномных праймеров (концентрация 0,2 мкМ). Стандартными условиями проведения ПЦР являлись: ( 95oC - 15'', 60oC - 10'', 72oC - 1'30''), х 28 циклов, хотя в некоторых случаях температуру отжига праймеров подбирали индивидуально. Проведение ОТ-ПЦР анализа, в том числе и количественной ОТ-ПЦР, детально описывается нами в соответствующих публикациях (ссылки даются в каждом разделе).
4.9 Гибридизация с зондами на последовательности U6 мяРНК и L1
Зонд на последовательность U6 был получен в ходе геномной ПЦР с 0.2 мM U6-специфичными праймерами, прямым 5'_TGCTCGCTTCGGCAGC-3' и обратным 5'_AAAAATATGGAACGCTTCACG-3', матрица - 40 нг геномной ДНК плаценты человека, условия - (95oC - 15'', 65oC - 10'', 72oC - 20''), х 28 циклов.
Зонд на последовательность L1 получали при геномной ПЦР ДНК человека с 0.2 мM уникальными прямым 5'_GATTATCTAAATGACCTACTTGCAC-3' и обратным 5'_CCAGAAGAAGTATAGCATGTTCAC-3' геномными праймерами, фланкирующими 5'-укороченный элемент семейства L1PA2 длиной 1375 пн (код доступа в GenBank AC037430). Условия ПЦР - (95oC - 15'', 65oC - 10'', 72oC - 1'), х 28 циклов.
Зонды метили 32P с помощью реактивов `Prime-a-Gene labeling system' (Promega) и гибридизовали при 68oC по стандартному протоколу.
4.10 Образцы кДНК тканей человека
(плаценты, зрелой тератомы, семиномы, нормальной паренхимы яичка и двух лимфом) были любезно предоставлены Т. В. Виноградовой (ЛСФГЧ, ИБХ РАН) и проверены с использованием стандартных бета-актиновых праймеров.
4.11 Гибридизация ДНК для метода MDR
Растворяли 800 нг каждого из подготовленных гибридизуемых образцов ДНК в 8 µл 1x гибридизационного буфера, денатурировали образцы при 95°C в течение 10 минут, затем гибридизовали при 65°C или 85°C в течение 50 часов. Гибридизационную смесь разбавляли 80 µл буфера следующего состава: 50 mM NaCl, 5 mM HEPES, pH 8.3, 0.2 mM EDTA. В некоторых экспериментах, к гибридизационной смеси добавляли конкурентную фракцию ДНК CotA (Gibco BRL).
4.12 Заполнение концов гибридизованной ДНК
1 единица полимеразы AmpliTaq DNA polymerase использовалась для достройки концов 1 микрограмма гибридизованной ДНК, инкубация 20 минут при 72°C.
4.13 Обработка нуклеазами, чувствительными к неспаренным нуклеотидам
100 нг-аликвоты гибридизованной ДНК обрабатывали 1 µл нуклеазы Surveyor (Transgenomic, США) в 20 µл 1x буфера, поставленного производителем фермента, ночная инкубация при 42°C, или обработаны 0.1 ед. нуклеазы Mung bean (Promega) при 37°C в течение 15 мин. ДНК очищали смесью фенол-хлороформ и высаживали этиловым спиртом.
Использованные сокращения
РУССКИЙ РЕГИСТР
ВГ, вычитающая гибридизация
ИКП, инвертированные концевые повторы
кДНК, комплементарная ДНК
мРНК, матричная РНК
ОТ, обратная транскрипция
ОТ-ПЦР, reverse transcription polymerase chain reaction
ПААГ - полиакриламидный гель
ПДРФ, полиморфизм длин рестриктных фрагментов
ПЦР, полимеразная цепная реакция
ССП, эффект супрессии ПЦР
ЛАТИНСКИЙ РЕГИСТР
BAC, англ. bacterial artificial chromosome, искусственная бактериальная хромосома
CC, англ. coincidence cloning, метод клонирования совпадений
CHS, англ. covalently hybridized subtraction
DSN, англ. duplex-specific nuclease, дуплекс-специфичная нуклеаза
DSNP, англ. метод duplex-specific nuclease preference
EST, англ. expressed sequence tag
FRET, англ. fluorescence resonance energy transfer
GREM, англ. метод genomic repeat expression monitor
LTR, англ. long концевой repeat, длинный концевой повтор
MDR, метод mispaired DNA rejection
MOS, англ. метод mirror orientation selection
NGSCC, англ. метод non-methylated genomic sites coincidence cloning
ODD, метод упорядоченный дифференциальный дисплей
PEER, англ. метод primer extension enrichment reaction
RACE, англ. rapid amplification of cDNA ends, быстрая амплификация концов кДНК
RDA, англ. метод representative differences analysis, репрезентативный дифференциальный анализ
SAGE, англ. метод serial analysis of gene expression, серийный анализ генной экспрессии
SL, от англ. stem-loop, сковородоподобная структура, содержащая петлю и комплементарно спаренное основание («ручка» сковородки)
SNP, англ. single nucleotide polymorphism, однонуклеотидный полиморфизм
SSCP, метод single-strand conformational polymorphism
SSH, англ. suppression subtractive hybridization, супрессионная вычитающая гибридизация
TGDA, метод targeted геномный difference analysis
TGDD, метод targeted genomic differential display
YAC, англ. yeast artificial chromosome, дрожжевая искусственная хромосома.
Общий список публикаций диссертанта
Исследовательские статьи:
1) E. Gogvadze, C. Barbisan, M.-H. Lebrun and A. Buzdin (2007) Tripartite chimeric pseudogene from the genome of rice blast fungus Magnaporthe grisea suggests double template jumps during long interspersed nuclear element (LINE) reverse transcription. BMC Genomics, 8(1):360
2) I. Kholodenko, R. Kholodenko, V. Sorokin, A. Tolmazova, O. Sazonova, A. Buzdin (2007) Anti-apoptotic effect of retinoic acid on retinal progenitor cells mediated by a protein kinase A-dependent mechanism. Cell Research, 17(2):151-62.
3) Buzdin A., Kovalskaya-Alexandrova E., Gogvadze E., Sverdlov E. (2006) At Least 50% of Human-Specific HERV-K (HML-2) Long Terminal Repeats Serve In Vivo as Active Promoters for Host nonrepetitive DNA Transcription. J Virol., 80(21):10752-62.
4) A. Buzdin, E. Kovalskaya-Alexandrova, E. Gogvadze, E. Sverdlov (2006) GREM, a technique for genome-wide isolation and quantitative analysis of promoter active repeats. Nucleic Acids Res., 34(9): e67.
5) I. V. Kholodenko, A. A. Buzdin, R. V. Kholodenko, J. A. Bibikova, V. F. Sorokin, V. N. Yarygin, and E. D. Sverdlov (2006) Mouse retinal progenitor cell (RPC) cocultivation with retinal pigment epithelial cell culture affects features of RPC differentiation. Biochemistry (Moscow) 71(7):767-74.
6) Kovalskaya, E., Buzdin, A., Gogvadze, E., Vinogradova, T., Sverdlov, E.D. (2006) Functional human endogenous retroviral LTR transcription start sites are located between the R and U5 regions. Virology, Mar 15; 346(2):373-378.
7) Gogvadze, E., Buzdin, A., Sverdlov, E. (2005) Multiple template switches during LINE directed reverse transcription is a general mechanism of the chimeric retroelement formation in mammals. Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 31(1):82-89
8) Chalaya T., Gogvadze E., Buzdin A., Kovalskaya E., Sverdlov E.D. (2004). Improving specificity of DNA hybridization-based methods. Nucleic Acids Res., 32(16):e130.
9) Buzdin, A., Gogvadze, E., Kovalskaya, E., Volchkov, P., Ustyugova, S., Illarionova, A., Fushan, A., Vinogradova, T., Sverdlov, E. (2003) The human genome contains many types of chimeric retrogenes generated through in vivo RNA recombination. Nucleic Acids Res., 31(15):4385-4390.
10) Buzdin, A., Lebedev, Yu., Sverdlov, E. (2003) Human specific HERV-K LTRs in gene introns have a non-random orientation and, possibly, participate in antisense regulation of the gene expression. Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 29(1):103-106.
11) Buzdin, A., Ustyugova, S., Khodosevich, K., Mamedov, I., Lebedev, Y., Hunsmann, G., Sverdlov, E. (2003) Human-specific subfamilies of HERV-K (HML-2) long terminal repeats: three master genes were active simultaneously during branching of hominoid lineages. Genomics, 81(2):149-156.
12) Buzdin, A., Ustyugova, S., Gogvadze, E., Lebedev, Y., Hunsmann, G., Sverdlov, E. (2003) Genome-wide targeted search for human specific and polymorphic L1 integrations. Human Genetics, 112(5-6):527-533.
13) Buzdin, A., Ustyugova, S., Gogvadze, E., Vinogradova, T., Lebedev, Y., Sverdlov, E. (2002) A new family of chimeric retrotranscripts formed by a full copy of U6 small nuclear RNA fused to the 3' terminus of L1. Genomics, 80(4):402-406.
14) Mamedov, I., Batrak, A., Buzdin, A., Arzumanyan, E., Lebedev, Y., Sverdlov, E. (2002) Genome-wide comparison of differences in the integration sites of interspersed repeats between closely related genomes. Nucleic Acids Res., 30(14):e71.
15) Buzdin, A., Revina, L., Kostina, L., Zalunin, I., Chestukhina, G. (2002) Interaction of 65- and 62-kD proteins from the apical membranes of the Aedes aegypti larvae midgut epithelium with Cry4B and Cry11A endotoxins of Bacillus thuringiensis. Biochemistry (Moscow), 67(5):540-546.
16) Buzdin, A., Khodosevich, K., Mamedov, I., Vinogradova, T., Lebedev, Y., Hunsmann, G., Sverdlov, E. (2002) A technique for genome-wide identification of differences in the interspersed repeats integrations between closely related genomes and its application to detection of human-specific integrations of HERV-K LTRs. Genomics, 79(3):413-422.
17) Krieger, I., Revina, L., Kostina, L., Buzdin, A., Zalunin, I., Chestukhina, G., Stepanov, V. (1999) Membrane proteins of Aedes aegypti larvae bind toxins Cry4B and Cry11A of Bacillus thuringiensis ssp. israelensis. Biochemistry (Moscow), 64(10):1163-1168.
обзорные статьи:
18) A. Buzdin (2007) Human specific endogenous retroviruses. TheScientificWorldJournal, 7: 1848-1868.
19) Buzdin A, Gogvadze E, Lebrun MH. (2007) Chimeric retrogenes suggest a role for the nucleolus in LINE amplification. FEBS Lett., 581(16):2877-82. Epub 2007 May 25.
20) Buzdin, A. (2006) Transposable elements and their use for target site specific gene delivery. Current Pharmacogenomics, March; 4(1): 1-8.
21) Gogvadze, E., Buzdin, A. (2005) New mechanism of retrogene formation in mammalian genomes: in vivo recombination during RNA reverse transcription. Molecular Biology (Moscow), May-Jun;39(3):364-373.
22) Buzdin, A., Vinogradova, T., Lebedev, Y., Sverdlov, E. (2005) Genome-wide experimental identification and functional analysis of human specific retroelements. Cytogenet. Genome Res.;110(1-4):468-474., in the special issue: "Retrotransposable elements and genome evolution"
23) Buzdin, A. (2004) Retroelements and formation of chimeric retrogenes. CMLS, Cell. Mol. Life Sci. 61(16):2046-2059
монографии, главы в книгах:
24) Монография “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Редакторы: Anton Buzdin и Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.
25) Nucleic acids hybridization: potentials and limitations (Anton Buzdin)
глава в книге “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Editors: Anton Buzdin and Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.
26) Selective suppression of polymerase chain reaction and its most popular applications (Sergey Lukyanov, Nadezhda Gurskaya, Ekaterina Bogdanova, Anton Buzdin).
глава в книге “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Editors: Anton Buzdin and Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.
27) Suppression subtractive hybridization (Sergey Lukyanov, Denis Rebrikov, Anton Buzdin).
глава в книге “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Editors: Anton Buzdin and Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.
28) Stem-loop oligonucleotides as hybridization probes and their practical use in molecular biology and biomedicine (Anton Buzdin, Sergey Lukyanov).
глава в книге “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Editors: Anton Buzdin and Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.
29) Coincidence cloning: robust technique for isolation of common sequences (Anton Buzdin).
глава в книге “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Editors: Anton Buzdin and Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.
30) DNA hybridization in solution for mutation detection (Anton Buzdin)
глава в книге “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Editors: Anton Buzdin and Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.
31) Current attempts to improve the specificity of nucleic acids hybridization (Anton Buzdin).
глава в книге “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Editors: Anton Buzdin and Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.
Выводы
Разработан метод, названный MDR (англ. Мispaired DNA Rejection), позволяющий значительно повышать специфичность отбора совершенных дуплексов при гибридизации. Метод также применим для поиска эволюционно консервативных последовательностей.