Диссертация: Полногеномные подходы к функциональному анализу повторяющихся элементов

(Б) Результаты 5'-RACE для LTR, расположенных в интронах генов SLB и SLC.

Для всех LTR, транскрибирующихся в нормальной паренхиме и семиноме, было проведено два раунда ПЦР с праймерами на 5'- адапторную последовательность кДНК и на ближайший к LTR экзон. В результате продукт был получен только в случае LTR, расположенного между 23 и 24 экзонами гена SLB (selective LIM binding factor, rat homolog; AC074117) и между 5 и 6 экзонами гена SLC (solute carrier family 4; AC027750). Эти продукты были отсеквенированы и оказалось, что точка начала транскрипции находится внутри LTR на границе R и U5 областей (826 нуклеотид консенсусной последовательности человек-специфического LTR), что совпадает с полученными нами ранее данными о точке начала транскрипции LTR семейства HERV-K. Таким образом, было показано, что из 13 человек-специфических LTR, расположенных в интронах известных генов в противоположной направлению транскрипции гена ориентации и удаленных от ближайшего экзона не более чем на 5 т.п.н., только 2 служат промоторами для транскриптов, перекрывающихся с экзонами клеточного гена. В дальнейшем проводился анализ только двух данных локусов.

Для более полной характеристики этих двух случаев был определен уровень транскрипции генов SLB и SLC, а также находящихся в них LTR для еще десяти тканей человека: скелетной мышцы, печени, сердца, легкого (нормы и опухоли), гиппокампа и эмбриональных тканей мозга (лобной доли, затылочной коры, базальных ядер и гипоталамуса) (таблица 2.4.2). Транскрипционная активность LTR, находящегося в интроне гена SLC, была показана только для нормальной паренхимы яичка, семиномы и эмбриональных затылочной коры, гипоталамуса и лобной доли. Причем во всех случаях уровень транскрипции LTR был ниже уровня транскрипции гена.

Транскрипт LTR, находящегося между 23 и 24 экзонами гена SLB, был найден во всех проанализированных тканях кроме нормальной ткани легкого. В большинстве случаев, как и для LTR в гене SLC, уровень транскрипции LTR оказался в 4-8 раз ниже уровня транскрипции гена (эмбриональные лобная доля и гипоталамус, печень, лёгкое (опухоль) и гиппокамп). В случае эмбриональных базальных ядер и затылочной коры LTR и ген транскрибируются на одном уровне. Для скелетной мышцы, сердца, паренхимы яичка и семиномы был показан более высокий уровень транскрипции LTR по сравнению с геном. Особого интереса заслуживает нормальная паренхима яичка, в которой LTR транскрибируется в 16 раз интенсивнее гена.

Для доказательства того, что во всех случаях мы имеем дело именно с транскриптами, комплементарными РНК гена, был проведен синтез первых цепей кДНК с праймером, избирательно связывающимся с антисмысловыми к гену РНК. После этого был поставлен ОТ-ПЦР с праймерами LTRfor и Gfor. Во всех случаях ПЦР-продукт получался на тех же циклах, как и при амплификации кДНК, синтезированной с oligo(dT)-праймером. Следовательно, найденные нами ранее транскрипты LTR действительно являются антисмысловыми к гену. А для доказательства того, что транскрипция антисмысловых РНК начинается внутри LTR, были поставлены ОТ-ПЦР с праймерами на 5'- конец LTR (LTRfor2) и на экзон анализируемого гена (Gfor). Как видно из таблицы 2.4.2, в большинстве случаев продукт не детектировался или же появлялся на значительно более поздних циклах, из чего следует, что промотором для антисмысловых транскриптов в этих случаях действительно служит 3'-конец LTR. Однако при анализе кДНК четырех тканей в случае гена SLB (гиппокамп и эмбриональные затылочная кора, гипоталамус и лобная доля) продукты ОТ-ПЦР с праймерами LTRfor2+Gfor и LTRfor+Gfor появлялись практически на одинаковых циклах. Можно предположить, что в этих тканях присутствует дополнительный промотор, расположенный в 5'-концевой части LTR или вышележащий относительно LTR и сонаправленый с ним.

Таблица 2.4.2. Результаты анализа уровня транскрипции генов SLB и SLC, а также LTR, расположенных в интронах этих генов*.

*Цифры обозначают цикл ОТ-ПЦР, на котором появлялся соответствующий продукт;

«-» - отсутствие детектируемого продукта; в качестве положительного контроля работы праймеров использовалась ДНК плаценты человека.

Рис 24. Схема расположения праймеров, использованных для определения 3'-конца транскриптов, начинающихся в LTR (A) и результаты серии ОТ-ПЦР для транскриптов LTR, находящихся в генах SLB (Б) и SLC (В). (цифры обозначают цикл ОТ-ПЦР, на котором появлялся соответствующий продукт; «-» - отсутствие детектируемого продукта; в качестве положительного контроля работы праймеров использовалась ДНК плаценты человека)

После этого была предпринята попытка определить 3'-конец транскриптов, начинающихся

После этого была предпринята попытка определить 3'-конец транскриптов, начинающихся в LTR, расположенных в интронах генов SLB и SLC. Нам не удалось получить необходимые результаты с помощью метода 3'-RACE, поэтому мы решили провести ОТ-ПЦР с праймером на 3'-конец LTR и серией праймеров, постепенно удаляющихся от LTR (рис 24).

В результате серии ОТ-ПЦР было показано, что в случае гена SLB существует, по крайней мере, 2 типа транскриптов: один включает в себя только экзон 23 (транскрипт 1), а второй - экзоны 23 и 22 (транскрипт 2) (рис. 2.4.4). Интересно отметить, что «длинный» транскрипт был найден только в нормальной паренхиме яичка, для которой была показана значительно большая активность LTR по сравнению с геном. В случае гена SLC 3'-конец транскрипта найден не был, но было определено, что весь экзон 5 входит в его состав (транскрипт 3).

Рисунок 2.4.4. Схематическое изображение транскрипционно активных LTR в интронах генов SLB и SLC и типы транскриптов, образующихся с промотора LTR.

На следующем этапе работы необходимо было определить, могут ли найденные транскрипты оказывать влияние на экспрессию соответствующих клеточных генов. Для этого предполагалось получить клеточные линии, стабильно экспрессирующие изучаемые транскрипты, и посмотреть, изменяется ли в этих клетках уровень транскрипции генов SLB и SLC.

Нами был проведен скрининг 8 клеточных линий человека и для дальнейшего анализа были отобраны линии Tera-1 и NGP127, для которых был показан наиболее высокий уровень транскрипции генов SLB и SLC.

Рисунок 2.4.5. Схематическое изображение плазмид, использованных для трансфекции клеточных линий NGP127 и Tera-1.

Фрагмент ДНК, соответствующий анализируемому транскрипту, был помещен в плазмиду pcDNA 3.1 Hygro- между промотором цитомегаловируса (PCMV) и сигналом полиаденилирования гена бычьего гормона роста (BGHpA). Стрелками внутри экзонов показано направление транскрипции генов SLB (плазмиды 1 и 2) и SLC (плазмида 3). В случае успешной интеграции плазмиды 1 в ДНК NGP127/Tera-1 получалась клеточная линия, стабильно экспрессирующая траскрипт 1 (см рис25); интеграция плазмиды 2 приводила к стабильной экспрессии транскрипта 2, а плазмиды 3 - к стабильной экспрессии транскрипта 3. Плазмида 4 - контрольная конструкция, не содержащая вставки. Трансформанты отбирались на среде с антибиотиком гигромицином.

На основе плазмиды pcDNA3.1 Hygro- были созданы три конструкции, каждая из которых содержала под контролем конститутивного цитомегаловирусного промотора (Pcmv) участок ДНК, соответствующий найденным в работе LTR-транскриптам (рис 26). Этими конструкциями были трансфицированы клетки Tera-1 и NGP127 и в результате получены клеточные линии, стабильно экспрессирующие интересующие нас транскрипты. Для каждой клеточной линии было проведено четыре трансфекции: 3 опытные (плазмидами, содержащими вставку соответствующего транскрипта) и 1 контрольная (плазмидой без вставки).

Важно отметить, что клетки, трансфицированные плазмидами со вставкой, оказались значительно менее жизнеспособными, чем контрольные. Таким образом, можно сделать вывод о негативном влиянии анализируемых транскриптов на жизнеспособность или пролиферативную активность клеток. Для проверки данной гипотезы был проведен эксперимент, позволяющий количественно оценить процент выживших клеток после трансфекции каждым типом плазмид. Для этого клетки Tera1 были трансфицированы четырьмя плазмидами и после 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7 и 10 дней инкубации определялось количество живых клеток. Результаты данного опыта представлены на рисунке 2.4.6. Как видно из графика, количество живых клеток в случае трансфекций плазмидами 1 и 4 (контрольной плазмидой без вставки) практически совпадает, из чего можно сделать вывод, что экспрессия транскрипта 1 не оказывает значительного влияния на жизнеспособность клеток. Экспрессия транскриптов 2 и 3, напротив, каким-то образом нарушает жизнеспособность или пролиферативную активность клеток, поскольку трансфекция плазмидами 2 и 3 приводит к заметному снижению количества живых клеток. Тот факт, что нам всё же удалось получить линии, стабильно экспрессирующих транскрипты 2 и 3 для клеток Tera-1 и NGP127, скорее всего, объясняется интеграцией конструкций в данных линиях в неблагоприятное геномное окружение, в котором активность промотора PCMV снижена. Дозированная экспрессия транскриптов типа 2 и 3, видимо, не критична для жизнеспособности клеток.

Рисунок 2.4.6. Результаты определения количества живых клеток после трансфекции. Трансфицированные клетки были рассеяны на 10 96-луночных планшет. Через 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7 и 10 дней в плашки добавлял MTT, избирательно окрашивающий живые клетки, после чего проводили спектрофотометрическое измерение при длине волны 540 нм. Для каждой точки проводилось 10-12 измерений. Среднее значение оптической плотности и стандартное отклонение указаны в таблице.

В результате опытов по трансфекции, мы получили 4 линии клеток NGP127 (NGP127-1 - клетки, стабильно экспрессирующие транскрипт 1, NGP127-2 - стабильно экспрессирующие транскрипт 2, NGP127-3 - стабильно экспрессирющие транскрипт 3 и NGP127-К - контрольные клетки, транфицированные плазмидой без вставки) и 4 линии клеток Tera-1 (Tera1-1 - стабильно экспрессирующие транскрипт 1, Tera1-2 - стабильно экспрессирующие транскрипт 2, Tera1-3 - стабильно экспрессирющие транскрипт 3 и Tera1-K (контрольные клетки, несущие плазмиду без вставки). Из всех клеточных линий была выделена РНК, методом ОТ-ПЦР показана эксперессия изучаемых LTR-транскриптов в полученных линиях клеток, после чего был проведен ОТ-ПЦР в реальном времени для определения уровня экспрессии генов SLB и SLC. Результаты ПЦР представлены в таблице 2.4.3.

В случае клеточной линии NGP не было выявлено статистически достоверного изменения уровня транскрипции генов SLB и SLC в опытных клетках по сравнению с контрольными. В данных клетках антисмысловые РНК, образованные с промотора LTR не регулируют транскрипцию соответствующих клеточных генов. Возможно, это связано с нарушением процессов РНК-интерференции в данной клеточной линии.