Диссертация: Полногеномные подходы к функциональному анализу повторяющихся элементов

Несмотря на отсутствие влияния антисмысловых РНК на транскрипцию соответствующих генов, для клеток NGP127, также как и для Tera1, было отмечено снижение выживаемости опытных клеток по сравнению с контрольными.

В случае же линии Tera1 было показано уменьшение количества РНК SLB в клетках, экспрессирующих транскрипт 1 (транскрипт, включающий только экзон 23 гена SLB) в 2,6 раза по сравнению с контрольными клетками (Pvalue<0,01), для более длинного транскрипта типа 2, перекрывающегося уже с двумя экзонами - снижение соответствующей таргетной мРНК уже в 3,8 раза. Также наблюдалось снижение уровня мРНК гена SLC в клетках, экспрессирующих транскрипт 3 - в 2,9 раз.

Таблица 2.4.3. Уровень транскрипции генов SLB и SLC в линиях клеток Tera1, стабильно экспрессирующих антисмысловые к гену транскрипты.

Таким образом, можно сделать вывод, что антисмысловые РНК, образованные с промотора LTR, могут уменьшать уровень транскрипции соответствующего клеточного гена (как было показано для клеток Tera-1). Кроме того, они способны влиять на жизнеспособность клетки, не нарушая транскрипции комплементарной РНК (как в случае трансфицированных клеток NGP127). На основании проведенного нами биоинформатического анализа транскриптов, образованных с промотора LTR, можно предположить несколько способов их влияния на клетку:

- связываясь с комплементарной РНК, они могут не приводить к её деградации, но нарушать трансляцию соответствующего белка;

- образовавшиеся РНК могут сами служить матрицей для синтеза коротких пептидов, токсичных для клетки;

- образовавшиеся РНК могут быть предшественниками микроРНК, блокирующих трансляцию других клеточных генов.

В будущем планируется подробно рассмотреть и экспериментально проверить эти гипотезы.

3. Повышение специфичности гибридизации в растворе

Как уже упоминалось в литературном обзоре настоящей работы, специфичность гибридизации является камнем предкновения для многих методов, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот в растворе. Например, образование химерных гетерогибридов - это настоящий бич метода Клонирования совпадений, особенно, когда речь идёт о гибридизации сложных смесей нуклеиновых кислот. В этой части речь идёт о разработанном нашей группой подходе, основанном скорее даже не на повышении специфичности гибридизации, а на устрожении требований к продуктам гибридизации, которые амплифицируются в ходе ПЦР на последующих стадиях.

Идея метода принадлежит диссертанту, основной объём экспериментальной работы был проведён Е.В.Гогвадзе, помощь в проведении экспериментов оказывала Т.В.Чалая, а за мудрые советы и общее руководство проектом коллектив особенно благодарен Е.Д.Свердлову.

3.1 Введение

Хорошо известный недостаток гибридизации сложных смесей ДНК - побочная гибридизация ДНК геномных повторов, присутствующих в сравниваемых образцах. В результате такого «неспецифического» отжига, итоговые клонотеки изобилуют химерными последовательностями, получившимися при гибридизации повторяющихся частей из неортологичных локусов (Рис. 3.1.1). Такие химеры абсолютно бесполезны при анализе клонотек и даже вредны, поскольку для того, чтобы понять, является ли последовательность химерой или же целевым продуктом гибридизации, приходится проводить достаточно трудоёмкий анализ каждой последовательности поотдельности. Химеры в среднем могут занимать 40-60% библиотек ДНК. Хотя ситуация может быть несколько улучшена при добавлении к гибридизационной смеси конкурирующей фракции геномной ДНК, обогащённой последовательностями повторов, количество нежелательных химерных клонов в библиотеках всё же остаётся высоким (см. ниже). Для того, чтобы улучшить создавшуюся ситуацию, нашей группой был разработан метод, названный Mispaired DNA Rejection (MDR), позволяющий свести к минимуму содержание химер в конечных библиотеках. Метод основан на том, что подавляющее большинство взаимно-отжигающихся геномных повторов, хотя и содержат значительную гомологию нуклеотидной последовательности, но всё же не полностью идентичны друг другу. Поэтому их ДНК-дуплексы не являются совершенными и содержат протяжённые или же короткие участки неспаренных нуклеотидов. Это могут быть как одиночные нуклеотиды, так и значительные по длине выпетливания. Все такие структурные отклонения от нормы, то есть совершенных ДНК-дуплексов, могут узнаваться и расщепляться особыми нуклеазами, названными здесь мисмэтч-специфическими нуклеазами (МСН). МСН служат in vivo как участники репарации геномной ДНК или в ходе прохождения жизненного цикла вирусов. В настоящее время МСН широко применяются для поиска и детекции мутаций (детально рассмотрено в литературном обзоре). В настоящем разделе речь пойдёт об использовании МСН для селективного расщепления химерных дуплексов в гибридизационных смесях, что позволяет снизить число побочных химерных клонов с 44-60 до 0-4%.

Рисунок 3.1.1. Образование химерных клонов в гибридизационных библиотеках.

3.2 Метод MDR: селективная деградация неправильно спаренных гетеродуплексов

Для тестирования эффективности MDR была разработана тест-система (Рис. 3.2.1), включающая (1) расщепление геномной ДНК частощепящей рестриктазой, (2) лигирование различных олигонуклеотидных супрессионных адапторов, (3) денатурацию-гибридизацию двух порций ДНК, содержащих разные супрессионные адапторы, (4) заполнение концов дуплексов ДНК-полимеразой, (5) обработка МСН и (6) ПЦР-амплификацию (с использованием эффекта ПЦР супрессии, детально описан в литературном обзоре) тех гетеродуплексов, которые не были расщеплены на предыдущей стадии.

Nested ПЦР с праймерами A2 и B2 повышает специфичность процедуры так, что в результате амплифицируется исключительно ДНК гетеродуплексов. Контрольные эксперименты содержали все те же самые стадии, помимо этапа (5), то есть обработки гибридов нуклеазами.

Рисунок 3.2.1. Схема метода MDR, использованная для тестирования эффективности обработки гетерогибридов МСН.

Для того, чтобы исследовать эффект от применения конкурирующей фракции ДНК, обогащенной геномными повторами, на процесс гибридизации и на качество итоговых библиотек, в некоторых экспериментах на стадии гибридизации добавляли 100-кратный избыток быстро реассоциирующей фракции геномной ДНК человека CotA, сильно обогащённой геномными повторами. На стадии (5) использовались две МСН: нуклеаза Surveyor, расщепляющая неспаренные участки в составе гетеродуплексов, а также нуклеаза Mung Bean, расщепляющая участки одноцепочечной ДНК, и, следовательно, способная атаковать петлевые структуры в составе химерных гибридов. Эксперименты проводили на ДНК млекопитающих, поскольку они относятся к одним из наиболее сложных геномов эукариот и дают чрезвычайно сложные гибридизационные смеси, гораздо более сложные, чем, например, ампликоны кДНК. Поэтому, в случае успеха для геномных ДНК млекопитающих, можно быть уверенными в применимости метода для более простых смесей (кДНК или геномы меньшей сложности). Проводили шесть различных гибридизаций при следующих условиях: (H1), две порции геномной ДНК человека гибридизовали при 65°C (T65) без добавления фракции CotA (CotA-) и без расщепления МСН (N-); (H2), ДНК человека и шимпанзе гибридизовали при T65, CotA-, N-; (H3), ДНК человека, T65, CotA+, N-; (H4), ДНК человека, T85, CotA+, N-; (H5), ДНК человека и шимпанзе, T65, CotA-, с добавлением нуклеазы Surveyor; (H6), ДНК человека, T65, CotA+, с добавлением нуклеазы Mung bean.

Получившиеся библиотеки клонировали в E.coli, и из каждой из них отсеквенировали по 50 вставок (всего 300 последовательностей). Для определения химерных клонов мы использовали следующие критерии: вся последовательность целиком не должна иметь гомологов в геномных базах данных, а её 5'- и 3'- концевые фрагменты должны идеально соответствовать геномным последовательностям. На рисунке 3.2.2 приведены результаты анализа полученных шести библиотек. Видно, что добавление фракции CotA и повышение гибридизационной температуры с 65 до 85°C практически не оказывают никакого эффекта на количество химерных клонов, в отличие от действия МСН. Как Mung bean, так и Surveyor показали мощный анти-химерный эффект, выразившийся в снижении их количества с 44-60% до 0-4% клонов (!).

Многие отсеквенированные вставки содержали геномные повторы, что неудивительно, поскольку повторы занимают порядка 50% ДНК млекопитающих. Повторяющиеся последовательности со 100% идентичностью могут соответствовать нескольким геномным локусам в ДНК хозяина, что существенно осложняет задачу их картирования. Поэтому часто встаёт задача минимизации содержания последовательностей повторов в библиотеках. В наших экспериментах получилось, что доля повторов значительно различалась в разных библиотеках: CotA- библиотеки содержали много повторяющихся последовательностей независимо от добавления МСН (87-93% всех отсеквенированных клонов), CotA+/N- библиотеки--несколько меньшую долю повторов (76-78%), тогда как CotA+/N+ библиотека (H6, с добавлением нуклеазы Mung bean) содержала всего 44% вставок с повторяющейся ДНК. Результаты свидетельствуют, что наилучшие результаты могут быть получены при конструировании библиотек с одновременным использованием МСН и конкурентных фракций вроде CotA.

Рисунок 3.2.2. Сравнение шести библиотек ДНК, полученных при разных условиях гибридизации без и с использованием МСН. H1, гибридизация ДНК человек-человек, 65°C (T65), без конкурентной фракции CotA (CotA-), без добавления МСН (N-);

H2, ДНК человек-шимпанзе, T65, CotA-, N-; H3, ДНК человек-человек, T65, CotA добавлена (CotA+), N-; H4, ДНК человек-человек, T85, CotA+, N-; H5, ДНК человек-шимпанзе, T65, Cot A-, добавлена нуклеаза Surveyor; H6, ДНК человек-человек, T65, CotA+, добавлена нуклеаза Mung bean. (A) Высота цветных столбцов соответствует доле химерных клонов в полученных библиотеках. (Б) Высота столбцов соответствует доле клонов, содержащих последовательности геномных повторов.

3.3 Приложение MDR для поиска эволюционно консервативных последовательностей в геномах человека и обезьян

Нами было проведено исследование применимости метода MDR для межвидовой ДНК-гибридизации. Для этого, в двух гибридизационных экспериментах (H2 и H5) гибридизовались ДНК человека и шимпанзе. Геномы человека и шимпанзе являются наиболее близкородственными и показывают 98% идентичность нуклеотидной последовательности. Получилось, что использование MDR снизило количество химерных последовательностей с 44% практически до нуля. Все отсеквенированные вставки из библиотеки, обработанной нуклеазой Surveyor (H5), содержали последовательности, высоко консервативные для этих двух геномов (средняя идентичность 98.3%). Некоторые вставки содержали участки, эволюционно консервативные для всех отсеквенированных на тот момент (ноябрь 2004) геномов млекопитающих - человека, шимпанзе, мыши и крысы. Из этого следовало, что MDR можно применять для поиска эволюционно консервативных последовательностей в различных геномах. Для исследования этого предположения, мы провели ещё одну межвидовую гибридизацию (H7), между геномами человека и обезьяны Нового света мармозеткой Callithrix pygmaea, при 65°C, с обработкой нуклеазой Surveyor. Геном мармозетки гораздо сильнее дивергировал от генома человека, чем ДНК шимпанзе [предковые линии гоминид и обезьян Нового света разошлись около 45 миллионов лет назад], дивергенция в среднем составляет 20% последовательности ДНК. 71% вставок библиотеки содержал умеренно (14%) дивергировавшие повторяющиеся элементы, присутствующие как в геноме мармозетки, так и у человека. Оставшиеся 29% представляли уникальные последовательности.

Десять из них были консервативны среди геномов человека, шимпанзе, мыши и крысы, а три других были консервативны между ДНК человека и шимпанзе. Для того, чтобы подтвердить высокую степень консервативности этих последовательностей между человеком и мармозеткой экспериментально, была проведена ПЦР-амплификация и секвенирование соответствующих локусов для трёх таких последовательностей. Оказалось, что действительно все отсеквенированные локусы показывали высокую степень консервативности между геномами со средним значением межвидовой гомологии 95%, что говорит о примерно 4-кратном понижении средней скорости мутирования для этих локусов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленные результаты убедительно свидетельствуют о том, что метод MDR может быть полезен для улучшения качества самых разных библиотек, получаемых при реассоциации ДНК, включая вычтенные или нормализованные геномные и кДНК-библиотеки. Хотя в наших экспериментах нуклеаза Surveyor оказалась незначительно более эффективной, чем Mung Bean, в других случаях последняя может быть также весьма полезна. В частности, обработка Mung Bean может помочь при гибридизации кДНК, когда образуется значительное количество несовершенных дуплексов при отжиге друг на друга в целом негомологичных последовательностей с похожими нуклеотидными мотивами. Поэтому, для рутинного применения можно рекомендовать смесь обеих нуклеаз. Метод также может значительно упростить решение задачи экспериментального поиска эволюционно консервативных последовательностей в несеквенированных геномах. Указанные особенности позволяют надеяться на широкую применимость метода для нужд молекулярной генетики.

4. Материалы и методы

4.1 Образцы геномной ДНК

Образцы геномной ДНК, использованные в ходе данной работы, были получены из 20 индивидуальных образцов плаценты человека, 18 проб крови человека, а также проб крови человекообразных обезьян, с использованием реактивов Genomic DNA Purification Kit (Promega, США), либо были получены напрямую из Германского Центра Приматологии от проф. Герхарда Хунсманна (Gerhardt Hunsmann).

4.2 Олигонуклеотиды

Все использованные в данной работе олигонуклеотиды были синтезированы В. К. Потаповым и Н. В. Скапцовой (ЛСФГЧ ИБХ РАН) на ДНК синтезаторе ASM-102U DNA (Биосан, Новосибирск, Россия). Структуры олигонуклеотидов приведены в соответствующих опубликованных статьях или далее в тексте раздела.

4.3 Приготовление ДНК Трейсера и Драйвера для метода TGDA

Рестрикция геномной ДНК человека и шимпанзе, лигирование супрессионных адапторов и ПЦР-амплификация фланкирующих ретроэлементы областей генома была проведена в соответствии с протоколом, опубликованном в (283).