Феномен селективной супрессии ПЦР (ССП), открытый в 1994 году (79), лежит в основе группы высокоэффективных, взаимнодополняющих методов поиска и анализа новых функционально значимых последовательностей ДНК и РНК, особенно полезных, когда первичная структура таких молекул неизвестна. Использование ССП позволило отбросить трудоёмкие и не всегда эффективные методы физического фракционирования ДНК и сделало методы поиска и анализа новых генов проще, быстрее и надёжнее.
2.2 Селективная супрессия ПЦР
Эффект ССП заключается в ингибировании амплификации молекул ДНК, фланкированных инвертированными концевыми повторами (ИКП), в ходе ПЦР с праймерами, соответствующими внешней части ИКП, при условии, что такие праймеры существенно короче, чем полная последовательность ИКП (Рис. 2.1).
Принцип супрессии ПЦР - целевая ДНК дизайнируется так, чтобы ее концы образовывали самокомплементарные шпильки. Как правило, задачей ССП является предотвращение амплификации нежелательных последовательностей в ходе ПЦР.
Самокомплементарные структуры, используемые для ССП, по форме напоминающие сковороду, создают при лигировании GC-богатых адапторов к рестриктным фрагментам ДНК или кДНК (Рис. 2.1) (79). В результате, каждый одноцепочечный фрагмент ДНК оказывается фланкирован инвертированными концевыми повторами (то есть самокомплементарными концевыми последовательностями). В ходе ПЦР, при денатурации и отжиге, самокомплементарные концы каждой одиночной цепи образуют шпильки, превращая каждый такой фрагмент в сковородоподобную структуру. Образование стабильного дуплекса на концах фрагментов ДНК делает неэффективным прохождение ПЦР только с праймерами, комплементарными последовательности адаптора (A-праймер на рисунке), благодаря тому, что внутримолекулярный отжиг комплементарных концов кинетически более предпочтителен и более стабилен, чем межмолекулярный отжиг более короткого А-праймера (79). Однако же в присутствии не только A-праймера, но также и праймера на целевую последовательность (таргетного праймера; T-праймер на рисунке), ПЦР становится эффективной. Т-праймер отжигается на свою целевую последовательность и нормально используется ДНК полимеразой для инициации синтеза ДНК. Новосинтезированая цепь ДНК уже не имеет самокомплементарных концов, и может быть эффективно амплифицирована с праймерами А и T. Соответственно, амплифицируются только те цепи, которые содержат таргетные последовательности, тогда как фоновые последовательности, не обладающие сайтом посадки таргетного праймера, остаются инертными.
Рисунок 2.1. Схема эффекта супрессии ПЦР. Молекулы ДНК, фланкированные инвертированными концевыми повторами, образуют внутримолекулярные концевые дуплексы, тем самым предотвращая отжиг праймеров, специфичных к последовательности адаптора и, следовательно, ингибируя ПЦР.
Эффективность ингибирования амплификации зависит от многих параметров, основными из которых являются следующие:
(1) Разница в температурах отжига ИКП и праймеров, используемых для амплификации. Соотношение длины и GC-состава целого ИКП и последовательности праймера сильно влияет на эффективность ССП. Использование ИКП длиной 40-50 пн с повышенным содержанием нуклеотидов G u C во внутренней (супрессионной) части, и адапторного праймера длиной 20-25 нт, соответствующего внешнему сегменту ИКП, представляется оптимальным.
(2) Длина ИКП-содержащей молекулы ДНК. Чем длинее молекула, тем меньше вероятность встречи и внутремолекулярной гибридизации её концов. Эффект ССП не работает или работает плохо при амплификации длинных фрагментов ДНК (более 6 тпн).
(3) Концентрация праймеров в реакционной смеси ПЦР. Успех ССП зависит от конкуренции внутримолекулярной гибридизации и отжига праймеров. Поэтому, эффект ССП более выражен при низких концентрациях праймеров.
2.3 Подготовка образцов ДНК, содержащих инвертированные концевые повторы
Используют два основных способа введения супрессионных последовательностей в молекулы ДНК:
(1) лигирование двуцепочечных фрагментов ДНК с псевдодвуцепочечными олигонуклеотидами, называемыми супрессионными адапторами (80);
(2) ПЦР с длинным (супрессионным) праймером, 3'-конец которого комплементарен амплифицируемым фрагментам ДНК (79).
Первый способ наиболее универсален, так как он не требует предварительного введения в ДНК каких-либо последовательностей. Образец ДНК для лигирования может быть приготовлен при обработке двуцепочечной кДНК или геномной ДНК эндонуклеазами рестрикции. При этом оптимально использовать ферменты, продуцирующие у рестриктных фрагментов тупые концы, поскольку в этом случае для различных ферментов может быть использован стандартный набор супрессионных адапторов. Второй способ может быть эффективен тогда, когда известна часть или вся последовательность амплифицируемого фрагмента: например, образцы кДНК, получаемые при добавлении гомополимерных последовательностей к первой цепи кДНК.
2.4 Стратегия применения различных вариантов ССП
ССП может быть использована для анализа сложных смесей фрагментов ДНК (кДНК или фрагментированных геномных ДНК) для супрессии нежелательной фоновой фракции ДНК при эффективной экспоненциальной амплификации целевых последовательностей. ССП позволяет проводить селекцию ассиметрично фланкированных молекул ДНК на фоне симметрично фланкированной ДНК. До открытия ССП, подобная задача не могла быть решена в ходе ПЦР. Можно обозначить три основных схемы применения ССП.
Первая схема (Рис. 2.2a) основана на добавлении одного и того же супрессионного адаптора ко всем молекулам ДНК. Затем проводят амплификацию с двумя праймерами, один из которых соответствует внешней части адаптора, а второй комплементарен таргетной ДНК (например, ген-специфичный или олиго(дT)-содержащий праймер). В ходе ПЦР происходит отбор молекул ДНК, несущих последовательность второго праймера. Эта схема соответствует таким методам, как поиск фрагментов геномной ДНК или кДНК, содержащих интересующую известную последовательность (80, 81), конструирование библиотек кДНК из малого количества тотальной РНК (82), а также упорядоченный дифференциальный дисплей кДНК (83).
Вторая схема (Рис. 2.2b) основана на добавлении двух различных супрессионных последовательностей к ДНК. После этого проводится амплификация с праймерами, соответствующими внешним частям адапторов. Во время ПЦР отбираются асимметрично фланкированные молекулы ДНК, то есть те, которые несут на концах последовательности разных адапторов. Эта схема применяется для метода клонирования in vitro (84).
Третья схема (Рис. 2.2c) является усложнённым вариантом предыдущей. К двум образцам ДНК добавляют различные 5'-концевые (но не 3'-концевые) супрессионные адапторы. Образцы затем денатурируют и гибридизуют. После достройки 3'-концов, проводят ПЦР с праймерами, соответствующими внешней части супрессионных адапторов. Как и во второй схеме, отбираются асимметрично фланкированные молекулы ДНК, но только в этом случае каждый такой дуплекс должен быть сформирован при гибридизации комплементарных цепей из разных образцов. Подобная селекция гетеродуплексов используется в вычитающей гибридизации кДНК (79), нормализации кДНК (85), модифицированном методе клонирования совпадений (76-78), и при поиске эволюционно консервативных последовательностей ДНК.
Рисунок 2.2. Основные стратегии, основанные на использовании эффекта ПЦР супрессии. A), один супрессионный адаптор лигирован к образцу; B), лигированы два различных адаптора; C) образец ДНК разделён на две части, к которым лигируют разлчные супрессионные адапторы.
2.5 Семейство методов, основанных на ССП
В настоящее время, при исследовании изменений экспрессии генов в ходе различных биологических процессов часто используется следующая стратегия: (1) конструирование библиотек кДНК из исследуемых биологических образцов; (2) скрининг этих библиотек на наличие генов (точнее, фрагментов этих генов), дифференциально экспрессирующихся или почему-либо интересных исследователям; (3) получение полноразмерных кДНК интересующих генов и определение их геномной структуры. Все эти стадии могут быть осуществлены с помощью методов, основанных на ССП (86).
В этом разделе будут рассмотрены некоторые такие методы: супрессионная вычитающая гибридизация, мультиплексная ПЦР и метод, названный targeted genomic differential display.
2.5.1 Создание библиотек кДНК с использованием малых количеств биологического материала
Создание библиотек кДНК требуется для большинства подходов к анализу экспрессии генов. Методы их получения из относительно большого количества биологического материала были разработаны сравнительно давно и сейчас являются рутинными процедурами. Однако же, такие методы бесполезны, когда количества биологического материала малы (что, пожалуй, характерно для большинства случаев).
ПЦР дала толчок методам конструирования библиотек кДНК из малых количеств тотальной РНК. Впрочем, использование ПЦР требует информации по крайней мере о части последовательности, которая должна быть амплифицирована. Поскольку мРНК абсолютного большинства генов содержит поли (А) последовательность, ПЦР может проводиться с олиго (дТ) содержащим праймером. Экспоненциальная амплификация требует введения искусственной последовательности также на противоположный конец кДНК для отжига второго праймера.
Было разработано несколько основных способов добавления таких последовательностей: (1) добавление гомополимерной последовательности к 3'-концу первой цепи кДНК с использованием терминальной дезоксинуклеотидил трансферазы (tailing) (87); (2) лигирование синтетического одноцепочечного олигонуклеотида к первой цепи кДНК (88) или к мРНК (89) при помоци T4 РНК лигазы; (3) лигирование двуцепочечного олигонуклеотидного адаптора к двуцепочечной кДНК при помощи Т4 ДНК лигазы (90).
Лигирование двуцепочечных молекул ДНК лигазой Т4 более эффективно и воспроизводимо, чем два другие метода (81). Впрочем, в своём первоначальном виде метод, основанный на использовании ДНК лигазы Т4 (90), имеет важный недостаток: он применим лишь к поли(А) + РНК. Если кДНК синтезируется на базе тотальной РНК, то даже использование олиго(дТ) содержащего праймера не может предотвратить синтеза избытка фоновой кДНК на матрице рибосомной РНК. На основе ССП, этот подход был значительно улучшен: к двуцепочечной кДНК при помощи T4 ДНК лигазы лигируют супрессионный адаптор, вслед за этим проводят ПЦР с олиго(дТ) содержащим праймером и с праймером, комплементарным внешней части адаптора (Рис. 2a) (82).
В ходе ПЦР происходит селективная амплификация фракции кДНК, содержащей сайт отжига олиго(дТ) праймера. В то же время, ССП ингибирует амплификацию остльной части кДНК, которая фланкирована адапторами с обеих сторон. Таким образом, библиотека кДНК может быть создана на основе малых количеств тотальной РНК без необходимости выделения поли(А)+ фракции (82). Библиотеки, созданные таким образом, применяли для анализа функционально значимых экспрессируемых последовательностей в самых разных биологических системах (91-93). Метод позволяет конструирование рептезентативных библиотек полноразмерных кДНК исходя из малых (10-100 нг) количеств тотальной РНК, сравнимых по качеству с библиотеками, получаемыми другими методами из 5-10 мкг поли(A) + РНК.
2.5.2 Детекция дифференцильно экспрессирующихся генов
Понимание молекулярных механизмов биологических процессов требует поиска и изучения генов, дифференциально экспрессирующихся в ходе этих процессов. Методы поиска таких генов основаны на детекции молекул мРНК, по-разному представленных в разных тканях и на разных стадиях исследуемого процесса. Изменения в количественном и качественном составе клеточных мРНК можно анализировать несколькими способами. Помимо микрочиповой гибридизации, наиболее широко используются два подхода: дифференциальный дисплей и вычитающая гибридизация.
2.5.2.1 Дифференциальный дисплей
Tехника дифференциального дисплея была разработана в 1992 г. (4) и вплоть до настоящего момента широко используется при поиске дифференциально экспрессирующихся генов. Используются короткие случайные олигонуклеотидные праймеры с низкими температурами отжига, которые инициируют ПЦР амплификацию ограниченного пула фрагментов кДНК. Сравнительный анализ таких амплифицированных образцов кДНК в ПААГ позволяет выявлять дифференциально представленные кДНК. Использование случайных праймеров, однако же, не позволяет проводить систематического сравнения образцов по всем типам мРНК: характеристический набор амплифицируемых фрагментов кДНК случаен, а кроме того, подавляющее большинство таких фрагментов относится к наиболее часто представленным транскриптам.
Также использование праймеров с низкими температурами отжига сопровождается неспецифической амплификацией и приводит к множественным артефактам. Другой подход включает в себя исчерпывающее сравнение всех типов мРНК на основе разделения молекул по наличию тех или иных рестриктных сайтов в 3' концевом фрагменте кДНК (94). Недостатки этого подхода - невысокая чувствительность и трудность выполнения протокола. Мац и коллеги разработали метод, названный ordered differential display (ODD), также основанный на анализе 3'-концевых рестриктных фрагментов кДНК (83). При этом, селекция фрагментов идёт при помощи ПЦР, а не физического разделения (Рис. 2.3). Это приводит к селективной амплификации 3'-концевых фрагментов кДНК (от олиго(дТ) содержащего праймера до ближайшего рестриктного сайта), что сильно упрощает метод и повышает его чувствительность. Эффективность метода ODD показали при поиске генов, дифференциально экспрессирующихся вдоль переднее-задней оси планарии (83).
Рисунок 2.3. Схема метода упорядоченного дифференциального дисплея (ODD), использующего эффект супрессии ПЦР для специфической амплификации 3'-концевых участков кДНК.