Тонкослойная хроматография (ТСХ). Метод ТСХ, получив- ший в настоящее время широкое распространение, был разработан Н. Измайловым и М. Шрайбер в 1938 году.
В методе ТСХ неподвижная твердая фаза тонким слоем нано- сится на стеклянную, металлическую или пластмассовую пластинку. В 2…3 см от края пластинки на стартовую линию вносят пробу ана- лизируемой жидкости и край пластинки погружают в растворитель, который действует как подвижная фаза ЖАХ. Под действием капил- лярных сил растворитель движется вдоль слоя сорбента и с разной скоростью переносит компоненты смеси, что приводит к их про- странственному разделению. Диффузия в тонком слое происходит в продольном и поперечном направлениях, поэтому процесс следует рассматривать как двумерный.
Основные элементы установок ТСХ. Подложки для сорбента (пла- стинки) обычно изготовляют из стекла, алюминиевой фольги или поли- эфирной пленки. Одно из достоинств пленки состоит в том, что она про- зрачна примерно до 320 нм и это позволяет проводить прямое фотомет- рирование многих веществ непосредственно в слое.
Сорбент может быть нанесен на подложку в виде пасты (закреп- ленный слой), тонкого порошка (незакрепленный слой) или быть приго- товленным при обжиге силикагеля на стеклянной пластине.
В качестве сорбента в ТСХ применяют силикагели, оксид алю- миния, крахмал, целлюлозу и некоторые другие вещества с высокой адсорбционной способностью. Эффективно применяются в качестве сорбентов жидкие иониты и вещества, обладающие ионообменными свойствами и свойствами молекулярных сит.
Выбор растворителя зависит от природы сорбента и свойств анализируемых соединений. Часто применяют смеси растворителей из двух или трех компонентов.
В восходящей хроматографии растворитель поднимается снизу вверх под действием капиллярных сил, в нисходящей - растворитель
передвигается по слою вниз под действием и капиллярных и гравита- ционных сил. Горизонтальная хроматография выполняется в виде круговой и со свободным испарением растворителя. В круговой хро- матографии в центр горизонтально установленной пластинки вносят каплю анализируемой смеси и непрерывно подают растворитель, ко- торый под действием капиллярных сил движется в радиальном на- правлении от центра. Компоненты смеси располагаются в слое в виде концентрических колец.
По окончании хроматографирования непроточным методом зо- ны на хроматограмме проявляют химическим или физическим спосо- бом. При химическом способе пластинку опрыскивают раствором ре- актива, взаимодействующего с компонентом смеси. После проявле- ния хроматограммы приступают к идентификации веществ и даль- нейшему анализу.
Жидкостно-жидкостная хроматография. ЖЖХ по сути близка к газожидкостной хроматографии. На твердый носитель также нано- сится пленка жидкой фазы, и через колонку, наполненную таким сор- бентом, пропускают жидкий раствор. Жидкость, нанесенную на но- ситель, называют неподвижной жидкой фазой, а растворитель, пере- двигающийся через носитель, - подвижной жидкой фазой. ЖЖХ мо- жет проводиться в колонке (колоночный вариант) и на бумаге (бу- мажная хроматография).
Колоночный вариант. Разделение смеси веществ основываются на различии коэффициентов распределения вещества между несме- шивающимися растворителями.
Поиск несмешивающихся фаз, обеспечивающих разделение, обычно производится эмпирически на основе экспериментальных данных. Широкое применение в ЖЖХ получили тройные системы, состоящие из двух несмешивающихся растворителей и третьего, рас- творимого в обеих фазах. Такие системы позволяют получать набор несмешивающихся фаз различной селективности.
Хотя в качестве подвижной и неподвижной фаз выбираются растворители, не смешивающиеся между собой, все же во многих системах наблюдается некоторая взаимная растворимость. Чтобы предотвратить процессы взаимного растворения жидкостей в ходе хроматографирования, подвижную жидкую фазу предварительно на- сыщают неподвижной.
Эффективность колонки связана с вязкостью, коэффициентом диффузии. С уменьшением вязкости подвижной фазы сокращается продолжительность анализа, но с увеличением вязкости несколько возрастает эффективность. Носитель неподвижной фазы должен обладать достаточно развитой поверхностью, быть химически инертным, прочно удерживать на своей поверхности жидкую фазу и не растворяться в применяемых растворителях.
Бумажная хроматография. В бумажной хроматографии применяют специфический носитель, позволяющий обходиться без колонки. Таким носителем является специальная хроматографическая бу-мага.
Хроматогафическаябумагадолжнабытьхимическичистой, нейтральной, инертной по отношению к компонентам раствора и подвижному растворителю и быть однородной по плотности. Имеют значение также такие свойства, как структура молекул целлюлозы в бумаге, набухаемость, ориентация волокна и другие, влияющие на скорость движения растворителя и на иные характеристики процесса. Для разделения водорастворимых веществ в качестве подвижной фазы обычно берут органический растворитель, а в качестве не- подвижной фазы - воду. Если вещество растворимо в органических растворителях, вода используется уже в качестве подвижной фазы, а органический растворитель является неподвижной фазой.
По технике выполнения различают следующие виды бумажной хроматографии: одномерную, двумерную, круговую и электрофоре- тическую. Для получения двумерных хроматограмм хроматографи- рование производят дважды во взаимно противоположных направле- ниях.
Весьма эффективным оказалось сочетание хроматографии и электрофореза, т.е. получение электрофоретических хроматограмм на бумаге. Воздействие электрического поля можно использовать или одновременно с хроматографированием, или последовательно, т.е. сначала провести электрофорез, а затем хроматографирование.
Методами распределительной жидкостной хроматографии ус- пешно анализируют смеси катионов в неорганическом качественном анализе, смеси аминокислот и других органических кислот, смеси красителей.
Высокоэффективная жидкостная хроматография. Хроматографирование на колонке - длительный процесс, поскольку продви- жение через пористый носитель под действием силы тяжести очень мало. Для ускорения процесса хроматографирование проводят под давлением. Такой метод называют высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЖХ), он позволил значительно сократить время анализа. На рисунке 1 представлена принципиальная схема жидкостного хроматографа с насосом для введения подвижной фазы под давлением. Однако при повышении скорости потока не успевает устанавливаться равновесие между фазами. Скорость установления равновесия контролируется в основном диффузией веществ, которая в жидкостях проте- кает очень медленно.
Рис.1.Схема высокоэффективного жидкостного хроматографа: 1-резервуарыдлярас- творителей; 2-многоходовой клапан; 3- насос; 4- ввод пробы; 5-термостатированная камера; 6- колонка; 7-детектор; 8-самописец
Чтобы свести к минимуму влияние диффузии и ускорить массооб- мен, нужно, чтобы гранулы носителя были как можно меньше, а пленка нанесенного растворителя как можно тоньше. При этом уменьшаются ко- эффициенты А и С в уравнении Ван-Деемтера, и тем самым вместо увели- чения наблюдается уменьшение высоты эквивалентной теоретической та- релки при повышении скорости потока.
Гель-хроматография. Это вид хроматографии, основанный на использовании различия в размерах молекул. Его называют также гель-фильтрацией или ситовой хроматографией. Неподвижной фазой в гель-хроматографии является растворитель, находящийся в порах геля, а подвижной - сам растворитель, т.е. и подвижную и неподвиж- ную фазы составляет одно и то же вещество или одна и та же смесь вещества.
В процессе гель-хроматографирования могут быть отделены крупные молекулы, которые гелем не сорбируются, так как их размеры превышают размеры пор, от мелких, которые проникают в поры, а затем могут быть элюированы.
Применяемые на практике гели подразделяют на мягкие, полу- жесткие и жесткие. Мягкими гелями являются высокомолекулярные органические соединения с незначительным числом поперечных свя- зей. Это - сефадексы, агарочные гели, крахмал. Фактор емкости - 3. Полужесткие гели получают путем полимеризации. Большое распро- странение получили стирогели. Фактор емкости от 0,8 до 1,2. К жест- ким гелям относят силикагели и часто пористые стекла, хотя они и не являются гелями. Фактор емкости - 0,8…1,1.
Растворители гель-хроматографии должны растворять все ком- поненты смеси, смачивать поверхность геля и не адсорбироваться на ней.
Практическое применение гель-хроматографии связано с разде- лением смеси высокомолекулярных соединений, хотя нередко они используются для разделения и низкомолекулярных, так как разде- ление этим методом возможно при комнатной температуре.
Ионообменная хроматография. Ионообменная хроматография основана на обратимом стехиометрическом обмене ионов, находя- щихся в растворе, на ионы, входящие в состав ионообменника. Широкое применение ионообменных процессов в практике началось после создания синтетических ионообменников, так называемых ионо- обменных смол или ионитов.
Применяемые в настоящее время синтетические ионообменники лишены многих недостатков, присущих естественным ионообменни- кам, и обладают рядом важных достоинств: они имеют высокую об- менную емкость и воспроизводимые ионообменные и другие свойст- ва, устойчивы к действию кислот и оснований, не разрушаются в присутствии многих окислителей и восстановителей. Обычно синте- тический ионообменник представляет собой высокополимер. Извест- ны синтетические неорганические иониты, например, различные пермутиты, активированный оксид алюминия, гели на основе соеди- нений железа или соединений циркония.
Типы ионообменных смол. В зависимости от знака разряда функциональных групп ионообменные смолы являются катионитами или анионитами. Катионы содержат кислотные функциональные группы [-SO3 , -COO , -PO3 , -N(CH2CO2 )], поэтому каркас катионита, несущий фиксированные отрицательные заряды, заряжен отрицательно. Отрицательные заряды каркаса компенсируются положительными зарядами противоионов, так что в целом катионит остается нейтральным. Однако противоионы, в данном случае катионы, в от- личие от функциональных групп каркаса обладают подвижностью и могут переходить в раствор в обмен на эквивалентное количество ио- нов из раствора.
Функциональными группами каркаса анионитов являются четвертичные - NR +, третичные - NR Н+ или первичные - NН + аммониевые, пиридиновые или другие основания, а в качестве подвижных противоионов выступают анионы.
Важной характеристикой ионообменника является его обменная емкость, определяемая в первом приближении числом функциональ- ных групп каркаса и степенью их ионизации при данном рН раствора. Обменную емкость ионита численно можно выразить количеством молей эквивалента противоиона на единицу массы или объема смо- лы.
Емкость, найденную в статических условиях, когда навеску смолы помещают в раствор насыщающего иона достаточной концентрации и выдерживают при встряхивании до полного насыщения, называют статической обменной емкостью. Величину емкости, полученную в динамических условиях при пропускании насыщающего раствора через колонку с ионитом, называют динамической обменной емкостью. Эта емкость ионита, определяемая по первому появлению насыщающего иона в вытекающем растворе. Полная обменная емкость находится по полному насыщению ионита данным ионом.
Практическое применение. Методы ионообменной хроматографии используются преимущественно для разделения ионов. Количественные определения компонентов после разделения могут быть выполнены любым подходящим методом. Простейшая методика ионообменного разделения состоит в поглощении компонентов смеси ионитом и последовательном элюировании каждого компонента под- ходящим растворителем.
Ионная хроматография. Это один из вариантов разделения на ионитах, характеризующийся более высокоэффективной техникой, чем обычная ионообменная хроматография В методе ионной хрома- тографии используются поверхностно-слойные сорбенты с неболь- шой емкостью (10-2…10-1 ммоль/г) и небольшим размером частиц (5…50 мкм), повышенное давление на входе в колонку (2…5 Мпа) и высокочувствительные детекторы с автоматической записью сигнала.
Для ионной хроматографии характерны экспрестность, удобство работы и более высокая разделительная способность.
Методы ионной хроматографии. В ионной хроматографии используют два основных метода: одноколоночный и двухколоночный.
В одноколоночной анионной хроматографии применяют элементы с низкой электрической проводимостью. В этом случае регистрируются так называемые отрицательные пики, которые появляются вследствие уменьшения электрической проводимости при замене гидроксид-иона в растворе на какой-либо анион. В катионной хроматографии элюирование проводят разбавленным раствором азотной или другой минеральной кислоты. Здесь также получаются отрица- тельные пики как результат замены ионов Н+, имеющих высокую подвижность, на какой-либо катион.