Материал: Генетика как наука

Митохондриальиая наследственность. Цитоплазматическая мужская стерильность

У большинства многоклеточных организмов митохондриальная ДНК наследуется по материнской линии. Яйцеклетка содержит на несколько порядков больше копий митохондриальной ДНК, чем сперматозоид. В сперматозоиде обычно не больше десятка митохондрий (у человека -- одна спирально закрученная митохондрия), в небольших яйцеклетках морского ежа -- несколько сотен тысяч, а в крупных ооцитах лягушки -- десятки миллионов. Кроме того, обычно происходит деградация митохондрий сперматозоида после оплодотворения. При половом размножении митохондрии, как правило, наследуются исключительно по материнской линии, митохондрии сперматозоида обычно разрушаются после оплодотворения. Кроме того, большая часть митохондрий сперматозоида находятся в основании жгутика, которое при оплодотворении иногда теряется. Так как митохондриальная ДНК не является высококонсервативной и имеет высокую скорость мутирования, она является хорошим объектом для изучения филогении (эволюционного родства) живых организмов. Для этого определяют последовательности митохондриальной ДНК у разных видов и сравнивают их при помощи специальных компьютерных программ и получают эволюционное древо для изученных видов. Исследование митохондриальных ДНК собак позволило проследить происхождение собак от диких волков. Исследование митохондриальной ДНК в популяциях человека позволило вычислить «митохондриальную Еву», гипотетическую прародительницу всех живущих в настоящее время людей. Для некоторых видов показана передача митохондриальной ДНК по мужской линии, например, у мидий. Наследование митохондрий по отцовской линии также описано для некоторых насекомых, например, для дрозофилы, медоносных пчел и цикад. Существуют также данные о митохондриальном наследовании по мужской линии у млекопитающих.

Цитоплазматическая мужская стерильность -- это наследование признаков, ограничивающих или сводящих на нет фертильность мужских растений (например, из-за образования дефектной пыльцы или даже полное её отсутствие, морфологические особенности цветка и т. п.), по материнскому типу через цитоплазму. Следует отметить, что вообще мужская стерильность у растений может определяться и рецессивным аллелем соответствующего ядерного гена. У кукурузы существует особый ядерный ген -- восстановитель фертильности (Rf/rf). Находясь в доминантном состоянии, он обеспечивает развитие нормального фертильного растения даже при наличии в цитоплазме фактора стерильности, а рецессивная аллель влияет на репродуктивную функцию при нормальной цитоплазме. Поэтому стерильными будут только растения, гомозиготные по рецессивному аллелю rf и имеющие в цитоплазме фактор стерильности. У кукурузы (Zea mays) плазмогены (то есть цитоплазматические факторы) мужской стерильности производят плейотропное действие: уменьшается число листьев, снижается устойчивость к некоторым болезням. Явление восстановления фертильности пыльцы используется на практике для появления гетерозисных двойных межлинейных гибридов кукурузы. Так как кукуруза самосовместима, то, чтобы исключить самоопыление, у некоторых растений приходилось обламывать мужские метёлки, то есть чтобы сделать их исключительно женскими особями. Так что гибриды CytSrf/rf (CytS -- стерильная цитоплазма, CytN -- нормальная цитоплазма) являются решением этой проблемы, поскольку имеют цитоплазматическую мужскую стерильность и неспособны к самооплодотворению.

Генетический анализ у микроорганизмов. Выявление и анализ биохимических мутаций у микроорганизмов (метод отпечатков, метод селективных сред)

Использование микроорганизмов в качестве объекта генетических исследований дало более широкие возможности изучения гена. Во-первых, в работе с микроорганизмами при относительно простом оборудовании есть все возможности анализировать практически неограниченное число особей. Во-вторых, микроорганизмы имеют, как правило, гаплоидный набор хромосом и совмещают в себе функции гаметы и особи. В-третьих, каждая особь представляет отдельную биохимическую лабораторию, в которой под генным контролем происходит синтез живого вещества. Изучение генетики микроорганизмов позволило обнаружить ранее неизвестные способы передачи наследственной информации. Открытие таких явлений, как трансформация, трансдукция, половой процесс у бактерий и парасексуальный цикл у грибов, раскрыли поистине сказочные возможности анализа основ наследственности.

Одним из начальных условий успешного проведения генетического анализа является овладение методами обнаружения мутаций и накопления возможно большего числа мутаций, касающихся различных признаков и свойств микроорганизмов. Анализ мутаций является одновременно и методом изучения наследственности. Для учета и выделения мутаций у микроорганизмов были разработаны специфические методы, отличные от таковых для высших животных. Дж. Ледерберг предложил усовершенствованный метод выделения биохимических мутаций у микроорганизмов -- метод отпечатков. Для облегчения пересева колоний, применяют специальную печатку, имеющую размер чашки Петри. Плоскость печатки покрывают бархатом. Сначала к печатке с бархатом прикладывают чашку с анализируемыми колониями, выросшими на полной среде. На ворсинках бархата остаются клетки отдельных колоний. Затем к этой печатке прикладывают две чашки -- с минимальной и полной средой. После инкубации таких отпечатков сопоставляют колонии, выросшие на полной и на минимальной среде. Практически это делают таким образом: чашку с минимальной средой ставят на чашку с полной средой так, чтобы идентичные колонии совпали. Просматривая две совмещенные чашки в проходящем свете, на чашке с полной средой отмечают колонии, которые не выросли на минимальной среде. Это дает возможность обнаружить мутантные колонии. Далее из мутантной колонии, выросшей на полной среде, делают отсевы на специальные среды, содержащие 1) только аминокислоты, 2) только витамины и 3) только основания нуклеиновых кислот. Колонии, не выросшие на одной из этих трех сред, относятся к мутантам, нуждающимся в одном из трех типов метаболитов. В дальнейшем проводят испытание на потребность в отдельном метаболите: определенной аминокислоте, витамине и т. д. Так обнаруживают прямые биохимические мутации у микроорганизмов. Для учета обратных биохимических мутаций, т. е. от ауксотрофного к прототрофному типу, применяют метод селективных сред. Селективной называется полная среда без какого-либо определенного метаболита, на которой могут расти лишь клетки определенного генотипа. На такой среде из большой популяции клеток отбираются единичные мутантные клетки. Например, высевая культуру кишечной палочки Е. coli, нуждающуюся в витамине -- биотине, на среду, лишенную его, можно отбирать мутации, восстанавливающие способность синтезировать биотин, так как к росту способны только клетки, претерпевшие обратные мутации, т. е. возвратившие способность синтезировать биотин. Среда, лишенная биотина и, следовательно, не пригодная для роста прямой мутантной формы, может служить селективной для обнаружения обратных мутаций. Кроме обратных биохимических мутаций, методом селективных сред легко обнаруживаются также мутантные клетки, устойчивые к различным ядовитым веществам и антибиотикам. Зная исходное разведение суспензии клеток, можно подсчитать концентрацию мутантов в исходной популяции.

Особенности процессов, ведущих к рекомбинации у прокариот. Конъюгация

Мутационный процесс и поток генов могут создать в популяции изменчивость по единичным генам. Если в результате таких первичных процессов возникает аллельная изменчивость по двум или большему числу генов, то создаётся почва для действия вторичного процесса -- рекомбинации, В результате рекомбинации новые аллели, носителями которых первоначально, вероятно, были разные особи, могут сочетаться в одном генотипе. За счет рекомбинации число различающихся генотипов в популяции может увеличиться; этот процесс превращает небольшой первоначальный запас изменчивости по множественным генам в гораздо более значительное количество генотипической изменчивости. Конъюгацией называется непосредственный контакт между клетками бактерий, сопровождаемый переносом генетического материала из клеток донора в клетки реципиента. Процесс конъюгации у бактерий E. coli (кишечной палочки) был открыт в 1946 г. Дж. Ледербергом и Е. Тэйтумом на основании генетического подхода. В основе полового процесса у бактерий лежит конъюгация клеток. Это явление выражается в появлении временной связи между клетками бактерий посредством образования цитоплазматического мостика. Такая связь создает условия для проникновения генетического материала из одной клетки бактерий в другую. При явлениях рекомбинаций у бактерий одна из линий служит донором, а другая реципиентом. донорные клетки (мужские клетки бактерий) характеризуются наличием у них особого фактора F+. При конъюгации бактерий фактор F+ может переходить в pеципиентную женскую клетку F, превращая ее в мужскую клетку. Бактерии F, т. е. лишенные полового факторы, являются реципиентами. При конъюгации клеток F+ и F в последнюю часто переходит только половой фактор. Однако когда фактор F+ в клетки донора интегрируется с ее хромосомой, то конец хромосомы донора начинает регулярно проникать через цитоплазматический мостик в клетку реципиента, обусловливая появление клеток, способных к особо высокой частоте рекомбинаций, которые были обозначены символом Hfr. Генетическая рекомбинация у бактерий происходит не только при половом процессе. Обнаружены также рекомбинации ДНК, идущие при трансформации и трансдукции.

Генетическая рекомбинация при трансформации. Исследования Ф.Триффитса на пневмококках

Изучение бактерий открыло целый ряд явлений, осветивших с новой стороны источники наследственной изменчивости и механизмы наследственной передачи. Одним из первых успехов в этой области было открытие явления трансформации у бактерий в 1928 г. Известно несколько штаммов пневмококка Diplococcus pneumoniae: штамм S -- с полисахаридной капсулой и гладкими колониями и штамм R -- без капсулы и с шероховатыми колониями. Оба эти признака наследственны. Бактериолог Ф. Гриффитс инъецировал мышам вместе с убитым нагреванием штаммом пневмококка, обладающим капсулой (S), штамм живого пневмококка, лишенного капсулы (R). Спустя некоторое время ему удалось выделить из зараженных мышей живых пневмококков, обладающих капсулой. Таким образом, оказалось, что свойство убитого пневмококка -- способность образовывать капсулу -- перешло к живой бактерии. Поскольку признак наличия капсулы является наследственным, то следовало предположить, что какая-то часть наследственного вещества от бактерий штамма S перешла к клеткам штамма R. Но как это могло произойти, если клетки штамма S были убиты? Можно было предполагать, что в этом случае либо возникла мутация, либо произошла своеобразная гибридизация между живыми и мертвыми бактериями. Первое объяснение было наиболее вероятным, однако вопреки здравому смыслу второе объяснение оказалось ближе к истине. В 1944 г. О. Эвери с сотрудниками удалось выяснить природу этого загадочного явления. Они взяли те же два штамма -- R и S. Перед началом решающих опытов было изучено спонтанное мутирование обеих форм. Оказалось, что гладкая S-форма хотя и очень редко, но спонтанно мутирует в R-форму, а R-форма практически вовсе не мутирует в S-форму, т. е. мутации происходят почти исключительно в одном направлении: S->R. Но если R-форму помещали в экстракт из убитых клеток S-формы, то частота изменений R->S увеличивалась в 10 000 раз. Стало очевидным, что признак одного штамма (S) через какое-то вещество экстракта передавался другому штамму (R), т. е. возникало направленное наследственное изменение. Далее была произведена тщательная очистка -- выделение этого вещества из экстракта клеток S-формы. Вещество было названо трансформирующим фактором (ТФ), а само явление -- трансформацией. Трансформирующий фактор по своей биохимической природе представлял собой не что иное, как дезоксирибонуклеиновую кислоту, входящую в состав хромосом. При этом было установлено, что он обладает некоторыми характерными свойствами. Его можно экстрагировать из клеток, очищать, воздействовать на него in vitro химическими и физическими факторами и затем снова вводить в живые клетки и изучать вызываемые им изменения. Явление трансформации стало одним из основных доказательств роли ДНК как носителя наследственной информации. Теперь термином «трансформация» обозначают особый способ гибридизации бактерий, при котором происходит включение ДНК из клетки одного генотипа (донора) в клетку другого генотипа (реципиента), приводящий к рекомбинации генов. Иначе говоря, трансформация представляет включение вещества хромосомы донора в хромосому реципиента.

Трансдукция у бактерий. Использование трансформации и трансдукции для картирования бактериальных генов. Кольцевая карта хромосом прокариот

Трансдукция -- процесс переноса бактериальной ДНК из одной клетки в другую вирусом бактериофагом. Общая трансдукция используется в генетике бактерий для картирования генома и конструирования штаммов. К трансдукции способны как умеренные фаги, так и вирулентные, последние, однако, уничтожают популяцию бактерий, поэтому трансдукция с их помощью не имеет большого значения ни в природе, ни при проведении исследований.

Трансформация служит хорошим инструментом для картирования хромосом, поскольку трансформированные клетки включают различные фрагменты ДНК. Определение частоты одновременного приобретения двух заданных характеристик (чем ближе расположены гены, тем более вероятно, что они оба включатся в один и тот же участок ДНК) даёт информацию о взаиморасположении соответствующих генов в хромосоме.

Феномен трансдукции может быть использован для картирования бактериальной хромосомы, если следовать тем же принципам, что и при картировании с использованием феномена трансформации

Основу генома прокариот - бактерий и др. составляют кольцевые молекулы ДНК: прокариотические хромосомы и плазмиды. Множество молекул ДНК образует две взаимосвязанные подсистемы: хромосомную и плазмидную.

Основу хромосомной подсистемы прокариотического генома составляет прокариотическая (бактериальная) хромосома (генофор), входящая в состав нуклеоида - ядерноподобной структуры. Нуклеоид по морфологии напоминает соцветие цветной капусты и занимает примерно 30% объема цитоплазмы. Бактериальная хромосома представляет собой кольцевую двуспиральную правозакрученную молекулу ДНК, которая свернута во вторичную спираль. Вторичная структура хромосомы поддерживается с помощью гистоноподобных (основных) белков и РНК. Точка прикрепления бактериальной хромосомы к мезосоме (складке плазмалеммы) является точкой начала репликации ДНК (эта точка носит название сайта OriC). Бактериальная хромосома удваивается перед делением клетки. Репликация ДНК идет в две стороны от сайта OriC и завершается в точке TerC. Молекулы ДНК, способные себя воспроизводить путем репликации, называются репликоны.

В прокариотических хромосомах число сайтов OriC может быть увеличено, например, у сенной палочки Bacillus subtilis их не менее двух.

Длина прокариотической хромосомы составляет несколько миллионов нуклеотидных пар (мпн); например, минимальная длина ДНК прокариотической хромосомы E. coli штамма MG1655 составляет 4639221 пн (физическая длина около 1,5 мм).