Главное преимущество этого подхода - практически 100% эффективность детекции мутаций в исследуемой ДНК и возможность точной локализации мутации (Рис. 6.2) в случае, когда контрольная ДНК и образец дифференциально окрашены (например, с помощью флуоресцентных реагентов). Самые серьёзные недостатки - большое количество стадий и использование вредных для здоровья реактивов. Техника была значительно усовершенствована, когда стали осуществлять химическое расщепление на твёрдой подложке: сначала, используя биотинилированные праймеры, заякоривали ДНК на стрептавидиновых гранулах (192), а затем перешли на неспецифическое связывание ДНК с силиконовой подложкой (193). При работе с твердофазной ДНК сильно упрощаются многочисленные стадии отмывки. Вариант силиконовой подложки предпочтительнее, поскольку он дешевле и не ограничивает количество меченных цепей ДНК. Следующее усовершенствование метода - мультиплексность (192), когда ДНК нескольких анализируемых локусов наносится на одну и ту же дорожку геля или в тот же капилляр (при этом используя различные флуорофоры как метки).
Метод используется во многих лабораториях, и можно привести успешные примеры его использования. Например, в 2004 он был применён для поиска мутаций в гене онкосупрессора p53 в группе из 89 пациентов с раком груди, при этом обнаружили три ранее неизвестные мутации в белок-кодирующей последовательности (194).
Впрочем, метод химического расщепления гораздо менее популярен, чем подход, основанный на энзиматическом узнавании, видимо, из-за большей сложности и токсичности используемых реагентов. При этом по чувствительности и точности детекции мутаций, химическое расщепление оказывается гораздо более надёжным методом, чем энзиматический подход, согласно экспериментам Дибли и соавторов (195) характеризующийся относительно высоким фоном.
6.3 Энзиматические методы
Этот группа методов гораздо более разнообразна, чем техники химического расщепления несовершенных дуплексов. Энзиматические подходы можно разделить на три основные группы: (1) использующие нуклеазное расщепление неспаренных нуклеотидов в гетеродуплексах (196), (2) основанные на аллель-специфичной ПЦР и (3) использующие связывание неспаренных участков некоторыми белками. Первая группа методов используется чаще всего из-за своей относительной простоты, хорошей воспроизводимости результатов и возможности точной локализации неизвестных мутаций, если такие попадаются в исследуемых образцах.
6.3.1 Нуклеазное сканирование мутаций
Сейчас известно множество самых разнообразных нуклеаз, как в плане строения, так и в плане активности и субстратной специфичности. Некоторые из них уже нашли применение для нужд биомедицины, некоторые пока нет (например, недавно открытый фермент, расщепляющий ДНК тетраплексной структуры (197)). Нуклеазные методы поиска мутаций основаны на том, что некоторые нуклеазы могут связывать и избирательно гидролизовать двуцепочечную ДНК по положениям неспаренных нуклеотидов. В зависимости от используемых нуклеаз, эти техники можно подразделить на три группы: (1) использующие резольвазо-подобные эндонуклеазы, (2) основанные на действии рестриктаз и нуклеаз, специфичных к одноцепочечной ДНК или РНК, и (3) использующие искусственные нуклеазы.
6.3.1.1 Эндонуклеазы, подобные резольвазам
Резольвазы бактериофагов - T7 эндoнуклеаза I и T4 эндонуклеаза VII, способны гидролизовать двуцепочечную ДНК по положениям неспаренных нуклеотидов. В 1995, три различные группы исследователей одновременно опубликовали одну и ту же идею использования резольваз для обнаружения мутаций (198-200). Резольвазы - это важная группа ферментов, катализирующих разрешение разветвлённых предшественников при созревании фаговой геномной ДНК. Их действие нацелено на точки ветвления, перегибы и другие отклонения в структуре двуцепочечной ДНК. Ферменты наносят разрывы вблизи таких неканонических структур (199). Например, T4 конецoнуклеаза VII стала первым обнаруженным ферментом, способным разрешать крестообразные структуры Холлидея. Фермент режет в двух местах: с 3' от точки основания неканонической структуры, и по другой цепи - с отступом в 6 нуклеотидов (200).
В 1990 году Козак и Кемпер в модельных экспериментах с синтетическими олигонуклеотидами показали, что T4 эндонуклеаза VII режет также по позициям единичных неспаренных оснований (201). Позднее, Юил и соавторы показали, что такое расщепление сильно зависит от того, какие именно нуклеотиды неспарены: пары G-A и G-G узнаются хуже, чем другие пары неспаренных нуклеотидов (200). Однако же, как показано в работах Машал и др.. (198), использование комбинации T4 эндонуклеазы VII с T7 эндонуклеазой I позволяет эффективно расщеплять все возможные варианты, включая даже короткие, порядка нескольких нуклеотидов, петлевые участки. Расщепление T4 эндонуклеазой VII успешно использовали для обнаружения новых полиморфизмов, обусловленных вариабильным числом тандемных повторов (202). При этом может происходить также и фоновое расщепление (около 20% активности фермента), возможно, связанное с образованием динамических вторичных структур ДНК в растворе (203)). Специфичность фермента удалось увеличить на два порядка при применении оптимизированных условий реакции (204).
Основные протоколы резольвазного сканирования мутаций просты и в общих чертах напоминают метод химического расщепления (Рис. 6.3). Интересующий геномный локус (обычно длиной 0.1-2 тпн, но в некоторых случаях - до 4 тпн), амплифицируют с уникальными праймерами с матриц исследуемой и контрольной ДНК. Продукты ПЦР смешивают, денатурируют и гибридизуют (205). Слишком длинные молекулы могут неправильно отжигаться друг на друга, поэтому рекомендуется держаться вышеприведённого интервала длин (206). Дуплексы обрабатывают эндонуклеазами и анализируют в полиактиламидном геле, при капиллярном электрофорезе или с помощью хроматографии. Размер расщеплённых продуктов показывает положение произошедшей мутации, что потом проверяется при секвенировании. Как и для химического расщепления, были предложены модификации метода, включающие введение флуоресцентных меток (205) и мультиплексность (207, 208).
Рисунок 6.3. Обобщённая схема нуклеазного подхода к обнаружению мутаций.
Позднее были открыты два других фермента с похожей активностью и неизвестными клеточными функциями: нуклеаза CEL I из сельдерея (209) и близкородственная ей нуклеаза Surveyor (210, 211).
CEL I делает одноцепочечные разрывы, тогда как нуклеаза Surveyor с высокой специфичностью гидролизует ДНК по обеим цепям, с 3' конца. Surveyor узнаёт все типы замен, а также инсерции и делеции длиной до 12 нуклеотидов. Впрочем, в 100-кратном избытке нуклеаза CEL I также гидролизует обе цепи (212). Преимущество использования нуклеаз CEL I и Surveyor заключается в их способности в стандартных буферных системах детектировать 100% вариантов однонуклеотидных мутаций, включая делеции и инсерции (209, 213).
По сравнению с химическим расщеплением, резольвазный подход оказался более популярным, благодаря простоте, отсутствию вредных реагентов и коммерческой доступности многих ферментов и даже специализированных китов для сканирования мутаций. Например, T7 эндонуклеаза I производится фирмой New England Biolabs, а нуклеаза Surveyor - компанией Transgenomic.
В ряде опытов была доказана эффективность рассматриваемого подхода. Например, в группе из 29 больных наследственным панкреатитом были обнаружены новые диагностические мутации в гене трипсиногена (214); анализ кодирующей последовательности гена p53 в 178 образцах рака прямой кишки выявил мутации в 51 случае (203); метод был применим для крупномасштабной детекции мутаций в двух генах митохондриальной тРНК, даже когда мутации присутствовали на весьма низком уровне (порядка 3%) в образцах тотальной ДНК пациентов с нарушениями дыхательной цепи (215); метод позволял выявлять мутации в гене p53 при соотношении мутантных аллелей к нормальным 1:20 (205). Можно также привести множество других примеров успешного применения метода (216);(208, 217).
Кроме того, резольвазы могут быть использованы для «неканонических» целей. Например, нуклеаза Surveyor применялась для селекции удачных клонов в ходе сайт-специфического мутагенеза (218), а T7 эндонуклеаза I, T4 эндонуклеаза VII и эндонуклеаза V E. сoli - для повышения точности искусственного синтеза генов из более коротких олигонуклеотидов (219).
Классический протокол расщепления резольвазо-подобными нуклеазами значительно эволюционировал, тем самым дав начало некоторым новым экспериментaльным техникам. Например, подход, разработанный Сокуренко и коллегами (212), позволяет даже сравнивать целые бактериальные геномы и находить однонуклеотидные различия между ними (Рис. 6.4). Метод разбит на шесть стадий: (1) смешение сравниваемых геномных ДНК, (2) фрагментация смеси рестриктазами, (3) фракционирование рестриктных фрагментов по длине, (4) денатурация-гибридизация фракционированной ДНК с образованием гетеродуплексов, (5) обработка нуклеазой CEL I и, наконец, (6) анализ обработанных фракций в агарозном геле. Если появляется мутация, это приводит к визуализации на геле двух новых полос фрагментов меньшей молекулярной массы. Фрагменты можно выделить из геля и отсеквенировать, что позволяет локализовать мутацию. С помощью этого подхода, авторам удалось обнаружить разнообразные мутации в геномах бактерий Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli и в различных изолятах рода Salmonella. Метод включает в себя много стадий и при этом трудоёмок, что препятствует его популяризации в научном сообществе.
Рисунок 6.4. Схема крупномасштабного скрининга SNP в бактериальных геномных контигах. Стадия 1: тотальная геномная ДНК двух сравниваемых штаммов выделяется и смешивается (полиморфный сайт обозначен жирной линией). Стадия 2: исчеспывающая рестрикция смеси геномных ДНК. Стадия 3: фракционирование рестриктных фрагментов по размеру. Стадия 4: Денатурация и гибридизация фракционированных фрагментов с образованием ДНК-гетеродуплексов (мутантный участок показан квадратом). Стадия 5: обработка дуплексов нуклеазой CEL 1. Стадия 6: анализ полученных фрагментов в агарозном геле.
Следующий метод, опубликованный Хуангом и коллеками (220), является элегантной модификации стандартного протокола, позволившей повысить специфичность получаемого на выходе сигнала. Авторы используют термостабильную бактериальную Эндонуклеазу V и ДНК лигазу (Рис. 6.5). ДНК образца и контроля метят флуоресцентно, смешивают, денатурируют и гибридизуют. Эндонуклеаза V Thermotoga maritima узнаёт и разрезает гетеродуплексную ДНК через один нуклеотид с 3' конца относительно неспаренного участка, а кроме того, на меньшем уровне даёт и нежелательное фоновое расщепление совершенных дуплексов. Используемая термостабильная ДНК лигаза из бактерии Thermus species репарирует фоновые разрывы, что значительно повышает специфичность всей тест-системы.
Рисунок 6.5. Высокоточная техника энзиматической детекции мутаций, основанная на репарации фоновых актов гидролиза при помощи ДНК лигзы. На стадии 4), ДНК лигаза сшивает разрывы, ошибочно внесённые нуклеазой на предыдущей стадии. При этом разрывы на месте неспаренных нуклеотидов остаются.
Миграция фрагментов в полиакриламидном геле позволяет найти позицию мутации. С помощью этого метода удалось обнаружить 31/35 уникальных точечных мутаций и 8/8 инсерций и делеций в исследуемых локусах (проверено секвенированием). Чувствительность метода позволяла детектировать мутантные аллели, разбавленные в соотношении 1:40 к аллелям дикого типа.
6.3.1.2 Рестриктазы, нуклеазы, специфичные к одноцепочечной ДНК и РНКазы
Расщепление неспаренных нуклеотидов в дуплексах исследуемой РНК с контрольной ДНК при помощи некоторых РНКаз было предложено более 20 лет назад (см. обзор (221)). Сначала использовалось расщепление РНКазой А; однако, этот фермент не может расщеплять многие варианты неспаренных нуклеотидов и в настоящее время заменён на другие ферменты, такие как РНКаза 1 и РНКаза T1. Интересно, что чувствительность метода увеличивается, когда ферменты используются одновременно с добавлением веществ - интеркаляторов нуклеиновых кислот (221). Самые серьёзные недостатки подхода - требование большого количества тестируемой РНК, а также неспецифическая деградация РНК.
Недавно для обработки гетерогибридов стали использовать также эндонуклеазы, специфичные к одноцепочечной ДНК. Например, в нашей работе (77) использовалась нуклеаза Mung bean для расщепления петлевых участков, образующихся в несовершенных гетерогибридах. Другая группа авторов в то же время стала использовать эту и другую нуклеазу сходной специфичности - S1 из чёрного аспергилла, для детекции однонуклеотидных замен (222). Оказалось, что в субоптимальных условиях (повышенные значения pH, температуры и содержания двухвалентных ионов) эти нуклеазы могут специфично расщеплять практически все варианты неспаренных нуклеотидов. Этот тип ДНКаз может стать предпочтительным для детекции мутаций, так как могут опознаваться не только однонуклеотидные замены, но также и значительно более длинные инсерции и делеции, часто игнорируемые резольвазами.
Для детекции мутаций могут также использоваться рестриктазы. Пример такого подхода - метод, недавно предложенный Че и соавторами для скрининга известных однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в исследуемых образцах (223). Используется рестриктаза типа IIS (Рис. 6.6). Рестриктный сайт вводится в один из двух праймеров для ПЦР таким образом, что рестриктаза расщепляет ДНК сразу за сайтом целевого SNP. При рестрикции продуктов ПЦР получаются структуры с торчащими 5'-концами на месте целевого полиморфного сайта. Этот 5'-торчащий конец используется для реакции удлинения комплементарной цепи на одно основание с использованием флуоресцентно меченных терминирующих нуклеотидов.