Метод клонирования совпадений (англ. Coincidence cloning) (КС) нацелен на поиск фрагментов ДНК, общих для сравниваемых образцов. Сравниваться могут образцы кДНК, геномной ДНК, как клонированные, так и неклонированные. Метод основан на клонировании идентичных или почти идентичных последовательностей, принадлежащих различным пулам фрагментированной геномной ДНК или кДНК, при этом отбрасываются дифференциальные последовательности. Ранние версии метода КС были не очень эффективны. Наиболее серьёзным недостатком являлась низкая селективность метода, так что получающиеся библиотеки содержали большую долю последовательностей, уникальных для одного из сравниваемых образцов. Современная модификация КС позволяет преодолеть это препятствие при помощи эффекта селективной супрессии ПЦР. Следующей важной проблемой является “неспецифическая” гибридизация между неортологичными геномными повторами или короткими фрагментами сходной последовательности, что приводит к получению химерных клонов, занимающих значительную часть библиотеки (до 60%, когда речь идёт о сложных геномных смесях). Важным усовершенствованием техники стало использование нуклеаз, специфичных для неспаренных участков в дуплексах, для обработки гибридов. При этом расщепляются несовершенные дуплексы, тогда как правильные нехимерные гетеродуплексы оказываются наиболее широко представлены в итоговой смеси (до 96% и более).
5.1 Введение
В отличие от вычитающей гибридизации, нацеленной на поиск дифференциальных последовательностей, метод, названный “клонирование совпадений” (КС) был разработан для поиска фрагментов ДНК, общих для исследуемых образцов. Согласно Ребекке Девон и Энтони Бруксу, которые были среди ранних разработчиков метода, “понятие клонирование совпадений включает в себя множество разных методик, целью которых является выделение последовательыностей ДНК, встречающихся в двух исходных образцах. Это могут быть образцы геномной ДНК или кДНК. Если это геномная ДНК, то в итоге будет получена смесь, обогащённая полезными маркерными последовательностями, присутствующими в обоих источниках. Если это один образец геномной ДНК и один - кДНК, то в результате получится смесь, содержащая гены, принадлежащие данному геномному локусу ” (73).
Сравнив фрагменты геномной ДНК с фрагментами упорядоченных геномных библиотек (например, отдельных BAC, космид, а также их перекрывающихся контигов), можно отобрать и идентифицировать геномные фрагменты, принадлежащие данному локусу. Для этого необходимо специфично пометить оба типа сравниваемой фрагментированной ДНК (например, лигировать разные концевые адапторные олигонуклеотиды), смешать образцы, денатурировать и гибридизовать ДНК, а затем выделить фракцию дуплексов, имеющих обе специфичные метки (“гетерогибриды”, сформированные общими для сравниваемых образцов последовательностями). Эта последняя стадия является краеугольным камнем всей процедуры, поскольку эффективное выделение фракции правильных гибридных дуплексов является залогом создание КС библиотеки, действительно обогащённой общими последовательностями (Рис. 5.1).
Рисунок 5.1. Общая схема клонирования совпадений. Правильное выделение гетеродуплексов образец 1 - образец 2 является ключевой стадией всех методов, основанных на CC.
Существуют три основных подхода к дискриминации гомо- и гетерогибридов. Первый из них (англ. cloning selection) основан на фланкировании ДНК исходных образцов (образец А и образец Б) различными рестриктными сайтами (например, сайты могут быть введены в состав лигированных концевых адапторов). Обработка продуктов гибридизации соответствующими рестриктазами позволяет лигировать гетерогибриды в вектор, предварительно расщеплённый таким образом, чтобы содержать пару требуемых липких концов. Второй подход (физическое разделение) использует иммобилизацию одного из образцов ДНК на твёрдом носителе (например, ДНК образца А, прикреплённая к магнитным гранулам). После гибридидзации, прикреплённая фракция, содержащая одноцепочечные молекулы А, гомогибриды А, а также гетерогибриды А/Б, отделяется от жидкофазной фракции, содержащей все остальные типы молекул. Далее прикреплённая фракция амплифицируется в ходе ПЦР с праймерами, специфичными для линкеров, фланкирующих ДНК Б, что приводит к более-менее специфичной амплификации гетерогибридов А/Б. Третий способ основан на селекции гетерогибридов исключительно в ходе ПЦР. К ДНК A и Б лигируют различные олигонуклеотидные линкеры, проводят гибридизацию, и амплифицируют продукты с парами А- и Б- специфичных праймеров.
Ранние версии технологии КС были достаточно низкоэффективны и не получили широкого распространения. Наиболее серьёзным их недостатком была низкая селективность, приводящая к невысокому содержанию гетерогибридных клонов в библиотеках. Эту проблему удалось решить, когда Ажикина и соавторы впервые применили подход селективной супрессии ПЦР (Глава 2; (10)) для повышения эффективности КС (74-76).
Следующей проблемой стала “неспецифическая” гибридизация между не-ортологичными повторяющимися элементами или короткими последовательностями сходной структуры, что приводит к образованию впечатляющей фракции химерных клонов (до 60% при гибридизации сложных геномных смесей, таких, как геномная ДНК млекопитающих). Химерные клоны заметно осложняют анализ библиотек, поскольку (а) часто бывает сложно отличить химеры от «истинных» гибридов, особенно в случае анализа несеквенированных геномов и (б) требуется больший объём работ по секвенированию библиотек. Недовно в нашей работе (77) было предложено решение этой проблемы, основанное на обработке гибридов нуклеазами, специфично расщепляющими ДНК по позициям неспаренных нуклеотидов (как одиночных нуклеотидов, так и протяжённых петлевых районов). При этом расщепляются несовершенные дуплексы (в основном химеры), тогда как фракция совершенных дуплексов сильно обогащается в итоговой смеси (до 96% клонов и более).
Кроме того, при использовании метода КС следует принимать в расчет кинетические параметры гибридизации (см. Главы 1 и 7). При гибридизации сложных смесей ДНК, скорость реассоциации уникальных фрагментов будет крайне мала. В частности, при сложности смеси свыше 5x108 пн (соответствует геномам арабидопсиса и дрозофилы), кинетика гибридизации становится лимитирующим фактором реассоциации (45). Для улучшения параметров гибридизации можно использовать повышенное время гибридизации, более высокие концентрации ДНК, более длинные фрагменты ДНК в смеси, а также некоторые другие приёмы (подробнее рассмотрено в Главе 7).
Последней проблемой является крайне низкая скорость реассоциации уникальных фрагментов ДНК. Скорость реассоциации каждого фрагмента ДНК пропорциональна квадрату его концентрации; значит, геномные повторы, представленные ~10 (некоторые псевдогены), ~1000 (многие семейства эндогенных ретровирусов млекопитающих), или ~1000000 (ретротранспозоны человека Alu) копий, будут реассоциировать, соответственно, в 102 -, 106 - и 1012 раз быстрее, чем уникальные последовательности. Следует учесть, что ~99% реассоциация сложных смесей может потребовать годы (!), а при использовании разумных сроков гибридизации (~дни), появляется огромный фон повторяющихся последовательностей. В последнем случае, огромное большинство двуцепочечных молекул в растворе представлено повторами, тогда как уникальные последовательности, в основном, остаются в виде незагибридизовавшихся одноцепочечных молекул. Примечательно, что специфичный для приматов ретротранспозон Alu был открыт именно при клонировании совпадений в последовательностях нескольких сравниваемых геномов (178, 179). Итак, истинное содержание различных геномных последовательностей в библиотеках КС, как правило, искажается.
Ситуацию с перепредставленностью повторов можно частично разрешить при добавлении в гибридизационную смесь избытка конкурирующей фракции ДНК, обогащённой геномными повторами (180). Такие конкурирующие агенты являются, как правило, фракциями бысто реассоциирующей ДНК, очищенной от одноцепочечной ДНК на гидроксиапатитовых колонках. Эти фракции, например, ДНК человека “Cot A” и “Cot B” фирмы Gibco BRL (США), могут быть использованы для существенного снижения фона повторяющихся элементов в библиотеках КС. Для этого исходная ДНК, подлежащая гибридизации, фрагментируется, помечается (лигированием адапторных последовательностей, включением биотина или других сигнальных молекул), денатурируется и гибридизуется с избытком конкурентной ДНК, взятой в 100-1000-кратном весовом избытке.
Основная часть повторов при этом загибридизуется с конкурентной ДНК. На следующей стадии, важно отделить “правильные” гибриды (образованные фрагментами исходной ДНК) от дуплексов с конкурентной ДНК и одноцепочечной ДНК. Для этого можно использовать систему селективной ПЦР амплификации или биотин-стрептавидиновую систему. Наши эксперименты показали, что использование фракции Cot A в 100-кратном весовом избытке снижает количество клонов, содержащих геномные повторы, с ~93% до 76-78% библиотеки при гибридизации смеси геномной ДНК человека (77). Замечу, что повторяющиеся элементы занимают около двух третей геномной ДНК человека (49, 50).
Для оценки эффективности клонирования совпадений, используется показатель, называемый enrichment factor (фактор обогащения). Он рассчитывается как частное относительного весового содержания целевых последовательностей в итоговой смеси к их относительному весовому содержанию в наиболее сложном из исходных образцов ДНК (73).
5.2 Селекция гетеродуплексов на стадии клонирования
Метод основан на предварительном мечении образцов ДНК различными лигированными олигонуклеотидными адапторами, несущими разные рестриктные сайты. Например (Рис. 5.2), образец A помечен рестриктными сайтами NotI, а Б - HindIII. Образцы смешивают, денатурируют и гибридизуют. После достройки концов, смесь обрабатывают рестриктазами, и фрагменты, порезовшиеся по обоим сайтам, клонируют в плазмидный вектор с соответствующими липкими концами. Теоретически, при этом клонироваться в E. coli должны только гетерогибриды А и Б. При помощи данного подхода, можно достичь значений фактора обогащения порядка 10-20 (178). Впрочем, минусом метода является высокий уровень клонирования побочных продуктов, в основном гомогибридов А или Б, лигированных в неполностью расщеплённый вектор по одному рестриктному сайту, а также клонирование большого количества химерных дуплексов (73).
Рисунок 5.2. Вариант техники клонирования совпадений, основанный на селективном клонировании гетеродуплексов по уникальной комбинации концевых рестриктных сайтов, отличающейся от рестриктных сайтов в гомодуплексах.
5.3 Физическое разделение гибридных молекул
Чтобы улучшить разделение гибридов, один из образцов ДНК можно иммобилизовать на твёрдую подложку (например, ДНК A, связанная с нейлоновым фильтром или с магнитными гранулами через биотинилированный праймер).
Перед гибридизацией, фракция геномных повторов в обоих образцах может быть блокирована избытком фракции Cot А. После гибридизации (Рис. 5.3), иммобилизованная фракция (содержащая молекулы типа A и гетерогибриды A/Б) отделяется от растворимой фракции. Здесь крайне важно правильно подобрать условия гибридизации и отмывки. Твердофазная фракция подлежит ПЦР амплификации с праймерами, специфичными для адапторов Б, что приводит к предпочтительной амплификации гетерогибридов A/Б. По сравнению с предыдущим подходом, значение фактора обогащения сильно возрастает для этой группы методов (~1000) (181, 182), но остаётся недостаточным для воспроизводимого анализа редкопредставленных последовательностей (73). Несмотря на дальнейшее развитие этой группы методов (183), выделение фракции гетерогибридов остаётся нетривиальной задачей, a проблема образования химерных гибридов и вовсе не решается. Клонирование совпадений таким способом не стало популярным методом среди научного сообщества. Эффект ПЦР супрессии, описанный далее, существенно улучшил метод и сделал стадию селекции гетерогибридов простой, эффективной и быстрой.
Рисунок 5.3. Селекция гетеродуплексов, основанная на (1) иммобилизации ДНК A на твёрдом носителе (магнитные гранулы) и (2) ПЦР с использованием комбинации праймеров, специфичных для образцов А и Б.
5.4 Подходы, основанные на ПЦР
Подходы, основанные на эффекте супрессии ПЦР (СП), были недавно созданы в работах Ажикиной и коллег (74-76). СП позволяет амплифицировать целевые последовательности и при этом репрессирует амплификацию фоновых фрагментов (см. Главу 2) (184). ПЦР эффективно проходит лишь в случае, когда происходит эффективный отжиг как праймера на адапторную последовательность, так и целевого праймера.
Рисунок 5.4 представляет упрощённую модель использования метода клонирования совпадений для поиска эволюционно консервативных последовательностей, присутствующих в обоих сравниваемых геномах (77). Геномную ДНК человека и обезьяны Нового Света мармозетки Callithrix pigmaea фрагментируют частощепящей рестриктазой, к полученным фрагментам лигируют два различных набора супрессионных адапторов. Образцы смешивают, денатурируют и гибридизуют, а затем достраивают концы дуплексов ДНК полимеразой (Рис. 5.4). Затем смесь обрабатывают нуклеазами, специфичными к неспаренной ДНК, для расщепления химерных гибридов (представленных частичными дуплексами) (см. Главу 7). На следующей стадии, смесь амплифицируют в ходе ПЦР с праймерами, специфичными к последовательности супрессионных адапторов, что приводит к селективной амплификации гибридов ДНК человека и Callithrix pigmaea. В результате авторам удалось создать библиотеку, высоко обогащенную эволюционно консервативными последовательностями, общими для геномов человека и Callithrix pigmaea.
Рисунок 5.4. Принцип метода mispaired DNA rejection (MDR). Обычно в ходе ПЦР амплифицируются не только целевые совершенные дуплексы идентичных последовательностей, но также и значительное число фоновых химерных дуплексов, обычно представляющих собой продукты гибридизации по последовательностям геномных повторов. Добавление нуклеаз, чувствительных к несовершенным гибридам, позволяет селективно расщеплять фоновые химерные дуплексы, тем самым, обогащая библиотеку целевыми последовательностями.
Следующим успешным подходом, основанным на клонировании совпадений, стал метод, названный “Non-метилированная genomic sites coincidence cloning (NGSCC)”, который применяется для поиска последовательностей, принадлежащих интересующему геномному локусу и содержащих неметилированные динуклеотиды CpG. В этом случае, сложность гибридизационной смеси не столь высока, как при полногеномной гибридизации, и обработка нуклеазами, чувствительными к несовершенным дуплексам, не требуется. Методика основана на фрагментации исходной геномной ДНК метил-чувствительной рестриктазой (Рис. 5.5). Для дальнейшего упрощения сравниваемых образцов ДНК, они обрабатываются частощепящей рестриктазой, нечувствительной к метилированию, например AluI. В итоге, длины получившихся фрагментов оказываются в рамках оптимума для эффективной ПЦР амплификации, то есть менее 1.5 тпн. Затем к липким концам, образованным метил-чувствительным ферментом, и к тупым концам, созданным AluI, лигируют разные супрессионные адапторы. В ходе дальнейшей ПЦР избирательно амплифицируются лишь фрагменты, имеющие неметилированный динуклеотид CpG с одной стороны и рестриктный сайт AluI с другой стороны.