Получившийся ампликон гибридизуют с образцом ДНК интересующего геномного локуса (авторы исследовали профиль метилирования локуса D19S208-COX7A1 19 хромосомы человека длиной около 1 млн пар оснований), который предварительно фрагментируют и к которому лигируют третий тип супрессионных адапторов. В ходе дальнейшей ПЦР, амплифицируются лишь неметилированные CpG-содержащие фрагменты, относящиеся к геномному локусу D19S208-COX7A1. Секвенирование получившихся библиотек, созданных для нормальной и раковой ткани, позволило авторам впервые создать крупномасштабную полную карту ткане- и опухоль- специфичных участков метилирования протяжённого геномного локуса (75). Позднее, те же авторы предложили комбинацию метода NGSCC с серийным анализом генной экспрессии (англ. serial analysis of gene expression, SAGE). Эта новая техника получившая название “RIDGES”, гораздо более информативна, чем NGSCC, поскольку на выходе получают в 10-20 раз больше информации о неметилированных сайтах с одного отсеквенированного клона (74).
Рисунок 5.5. Метод NGSCC. (A) Селективная амплификация фрагментов Alu I-Hpa II/Hha I. Горизонтальными линиями обозначена геномная ДНК и ДНК космидных контигов. Сайты узнавания Alu I и Hpa II/Hha I обозначены буквами ``A и ``H '', соответственно. Супрессионные адапторы A и H изображены как белые прямоугольники в своей общей (внешней) части, и по-разному в своей внутренней части, различающейся для разных рестриктных сайтов. (Б) Клонирование совпадений с использованием селективной супрессии ПЦР. Фрагменты, уникальные для одного из образцов, обозначены пунктиром и прерывистой линией. Общие фрагменты обозначены непрерывной линией. Супрессионные адапторы B и C изображены в виде черных и белых прямоугольников.
Метод клонирования совпадений используется не только для анализа геномной ДНК. В частности, недавно опубликованная техника, названная genomic repeat expression monitor (GREM) использует клонирование совпадений пре-амплифицированных геномных участков, фланкирующих повторяющиеся элементы с 3' конца, и набора 5'-концевых фрагментов кДНК. В результате получают гибридную библиотеку геномная ДНК/кДНК, обогащенную транскрипционно-активными повторами. Это позволяет создавать исчерпывающие полногеномные карты геномных повторов, обладающих промоторной активностью (78, 185). GREM применяли для исследования активности длинных концевых повторов (LTR) эндогенных ретровирусов человека (19). Метод включает в себя три основных стадии (Рис. 5.6): (а) синтез полноразмерной библиотеки кДНК с 5' концом, помеченным специальным олигонуклеотидным адаптором, (б) селективная ПЦР амплификация геномных фланков повторяющихся элементов, и (в) гибридизация фланков геномных повторов с кДНК и последующая ПЦР амплификация гетеродуплексов геномная ДНК-кДНК.
Рисунок 5.6. Схема метода GREM. Метод включает три основные стадии: (1) полногеномная амплификация геномной ДНК, фланкирующей повторяющиеся элементы (здесь обозначены как HS LTR) с 3' конца. Обработка ампликона экзонуклеазой ExoIII продуцирует 5'-выступающие концы, нужные на третьей стадии. (2) Синтез библиотеки кДНК. кДНКs маркируется по позиции транскрипционного старта РНК адапторным олигонуклеотидом (CS) при помощи эффекта “cap-switch”. кДНКs расщепляется рестриктазой Alu I, не имеющей сайтов узнавания в составе HS LTR. Этот шаг предотвращает амплификацию последовательностей LTR, транскрибируемых насквозь с вышележащего экзогенного промотора. (3) Ампликон геномной ДНК (1) гибридизуют с 5'-помеченными кДНК (2). Выступающие концы ДНК заполняют ДНК полимеразой, а получающиеся гибриды (ELT) амплифицируют в ходе ПЦР с праймерами, специфичными к последовательностям фланкирующего адаптора и 5' концевого тага кДНК.
Полученные ампликоны клонируют и секвенируют. При этом каждый гетеродуплекс содержит 3' концевой фрагмент геномного повтора, фланкирующую ДНК и адапторную последовательность. GREM позволяет характеризовать промоторную активность как на качественном, так и на количественном уровне, поскольку число гетеродуплексов каждого типа линейно коррелирует с транскрипционной активностью соответствующих промоторов.
5.5 Краткое заключение
Использование эффекта ПЦР супрессии сделало клонирование совпадений предпочтительным методом для целого ряда экспериментальных задач, включающих нахождение общих последовательностей. Введение стадии обработки гибридизационной смеси нуклеазами, чувствительными к несовершенным дуплексам, существенно повышает достоверность CC, что особенно важно при анализе сложных смесей, например, геномных ДНК млекопитающих. То, что за один эксперимент сравнивают лишь два образца, кажется важным ограничением, но объединение нескольких образцов ДНК в два пула может являться частичным решением проблемы. Клонирование совпадений предоставляет преимущества при решении следующих задач: (1) поиск общих транскриптов в исследуемых образцах тканей (например, для поиска генов, ко-экспрессирующихся в опухолях), (2) для экспериментального картирования известных или неизвестных транскриптов на последовательности геномных контигов, (3) для полногеномной идентификации транскрипционно активных геномных повторов, для их картирования и количественной характеристики транскрипционной активности, (iv) для поиска метилированных или неметилированная динуклеотидов CpG на протяжённых участках геномов, и, наконец, (5) для быстрого поиска эволюционно консервативных последовательностей из сравниваемых геномов.
6. Гибридизация ДНК в растворе для детектирования мутаций
Эта группа методов нацелена прежде всего на поиск небольших (порядка единиц нуклеотидов) различий между сравниваемыми образцами ДНК. Детекция мутаций и полиморфизмов привлекает постоянно растущий интерес, прежде всего, благодаря связи с исследованием нормальных функций генов, белков, некодирующих РНК, причин развития наследственных заболеваний, а также различий в спектре индивидуального ответа на условия среды. Множество однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) не вредны сами по себе, но связаны с фенотипами, ассоциированными с болезнями или особенностями ответа на лекарственные препараты, что позволяет использовать их в популяционно-генетических и ассоциативных исследованиях. За последние годы были найдены миллионы SNP. Однако же, это количество ничтожно по сравнению с реальным числом SNP и других мутаций, присутствующим в геномах. Многие методы поиска мутаций быстро и эффективно показывают само наличие мутации в исследуемой области, но при этом не позволяют охарактеризовать ее и найти точную локализацию; другие подходы позволяют проводить точное картирование мутаций, но при этом гораздо более сложны в исполнении и ресурсоёмки. В этой главе будет рассмотрена группа новых подходов, комбинирующих высокую производительность, относительную дешевизну, надёжность и при этом детальную характеризацию мутаций.
6.1 Введение
В отличие от вычитающей гибридизации, которая нацелена на поиск относительно длинных дифференциальных фрагментов, эта группа методов создана для идентификация очень коротких, порядка единиц нуклеотидов, различий между сравниваемыми образцами ДНК. Детекция мутаций и полиморфизмов становится всё более важной задачей в области молекулярной генетики. Мутации вызывают генетическую вариабильность среди живых существ, в частности, врождённые болезни и предрасположенность к некоторым побочным эффектам лекарств. Изучение мутаций позволяет понять нормальные функции генов, белков, некодирующих РНК, причины многих болезней, а также многообразие физиологических ответов на условия среды. Множество мутаций не вредны сами по себе, но связаны с генотипами, ассоциированным с болезнями. Это подстёгивает крупномасштабные исследования по ассоциации полиморфизмов и популяционной генетике. Более того, общепризнанна важность SNP как важных диагностических маркёров для детекции опасных и лекарственно-устойчивых штаммов микроорганизмов.
На настоящий момент известны миллионы SNP, но это количество ничтожно в сравнинии с реальным их числом в человеческих популяциях. Поэтому, разработка методов детекции мутаций, подразумевающах возможность определять различия в структуре ДНК с точностью до нуклеотида, при этом недорогих и ~100% эффективных - это одна из основных задач сегодняшней молекулярной генетики. Идеальный метод позволял бы детектировать мутации в больших фрагментах ДНК, картировать их с точностью до нуклеотида, был бы чувствителен, точен и производителен. Этот идеал ещё не достигнут, и используется множество самых разнообразных методик, имеющих свои недостатки и преимущества.
Поиск мутаций наиболее часто проводится при помощи секвенирования по Сэнгеру, что часто считается чуть ли не единственно верным подходом. Действительно, огромная масса новых мутаций, в основном SNP, была недавно открыта при биоинформатическом анализе имеющегося материала по секвенированию геномов и транскриптомов.
Однако же, масштабное секвенирование не всегда доступно при анализе большого количества образцов, и требуются иные подходы. Возможно, в будущем всё заменит собой усовершенствованная форма пиросеквенирования (186, 187), но на настоящий момент используется множество других техник крупномасштабного сканирования мутаций. Все они основаны на том, что молекула ДНК, содержащая мутацию, в составе гетеродуплекса с ДНК дикого типа, содержит одно или несколько неспаренных оснований в позиции мутации (Рис. 6.1).
Рисунок 6.1. При гибридизации с ДНК дикого типа, мутантная ДНК образует гетеродуплекс с одним или более неспаренными основаниями. Именно эти неспаренные основания и «ловятся» большинством методов скрининга мутаций.
Таким образом, когда вместе гибридизуются мутантные и нормальные цепи ДНК, образуется два типа несовершенных дуплексов. Например, в случае замены T>C, в двух гетеродуплексах будут наблюдаться неспаренные варианты T- G и C-A. Детекция и правильное картирование таких неспаренных нуклеотидов и являются ключевым звеном поиска мутаций. Неспаренные нуклеотиды можно идентифицировать прямо или опосредованно с помощью разнообразных химических, энзиматических и физических подходов. Следует отметить, что определение новой мутации обязательно требует стадии секвенирования, по крайней мере для подтверждения полученных результатов. Но в этом случае направленно секвенируют небольшой участок ДНК, а не огромный локус, как в случае, когда мутации находят в ходе масштабных проектов по секвенированию. В результате, альтернативные методы позволяют уменьшить стоимость детекции мутации на один порядок величины и более. Ричард Коттон, один из ведущих учёных в этой области, пишет: “Изобретена куча таких методов, каждый из них имеет свои особенности… Все эти методы постоянно усовершенствуются своими создателями и пользователями, так что жизнь тех, кто озабочен поиском мутаций, потихоньку улучшается, хотя пока и не видно волшебного универсального метода, который бы решил все проблемы в ближайшем будущем” (188).
Большая часть таких методов детекции мутаций основаны на ПЦР и на образовании гетеродуплексов между ДНК дикого типа и мутантными цепями. Вкратце, химические подходы используют химическое расщепление или модификацию по позиции неспаренных нуклеотидов, Энзиматические основаны на энзиматическом узнавании неспаренного участка (с последующим связыванием, расщеплением, модификацией или лигированием ДНК по неспаренным позициям), а физические методы ищут различия между физическими свойствами совершенных и несовершенных дуплексов.