Такие меченые фрагменты могут быть разрешены, например, при капиллярном электрофорезе. Можно дизайнировать праймеры таким образом, что получаемые продукты будут варьировать по длине, что позволит наносить в один капилляр до 44 фрагментов. Теоретически, количество SNP за один прогон может быть даже увеличено до 50-100 на один капилляр.
Рисунок 6.6. Техника Single-base extension (SBE) для мультиплексной детекции мутаций. Теоретически, в одном эксперименте можно проскринировать 50-100 потенциальных мутационных сайтов. Один из используемых праймеров несёт сайт узнавания рестриктазы типа IIS, подобранный таким образом, чтобы фермент производил разрыв сразу после исследуемого сайта SNP. Рестриктаза образует 5'-выступающий конец в целевом полиморфном участке. Этот выступающий конец застраивается на одно основание при помощи флуоресцентно меченных дидезоксинуклеотидов. Полученные различные фрагменты разрешают в ходе капиллярного элексрофореза на секвенаторе.
В таких довольно редких случаях, когда определяемая точечная мутация разрушает некий существующий рестриктный сайт, можно использовать простую, дешёвую и чувствительную технику, основанную на обработке гетеродуплексов соответствующими рестриктазами (например, (224)). Недостатки метода - его редкая применимость и невозможность поиска новых мутаций.
Наконец, последний метод, рассматриваемый в этом разделе, создан для детекции SNP и основан на применении нового типа нуклеаз - нуклеазы, избирательно расщепляющей ДНК дуплексы (225). Дуплекс-специфичная нуклеаза из Камчатского краба (DSN) предпочтительно расщепляет ДНК в дуплексах ДНК-ДНК и ДНК-РНК, и неактивна по отношению к одноцепочечной ДНК. Кроме того, эта нуклеаза расщепляет совершенные дуплексы с гораздо большей скоростью, чем несовершенные гибриды. Таким образом DSN способна «чувствовать» даже однонуклеотидные замены. В разработанной авторами методике, содержащий сайт SNP участок ДНК амплифицируется в ходе ПЦР, продукт смешивается с сигнальными зондами (короткие олигонуклеотиды, специфичные для мутантного аллеля или для аллеля дикого типа, по-разному помеченные в системе FRET (fluorescent resonance energy transfer)) и с DSN (Рис. 6.7).
Во время инкубации, DSN расщепляет только совершенные дуплексы между исследуемой ДНК и сигнальными зондами, что по характеру флуоресценции позволяет понять, присутствует ли в исследуемом образце мутантный аллель. Метод эффективен при исследовании известных SNP, но не может быть использован для поиска новых мутаций.
Рисунок 6.7. Схема метода DSNP. Черная звёздочка обозначает первый донор флуоресценции, серая - второй, а кружок обозначает гаситель флуоресценции.
6.3.1.3 Искусственные эндонуклеазы
Последняя группа нуклеазных методов детекции мутаций подразумевает обработку гибридов ДНК искусственными нуклеазами, узнающими и расщепляющими специфическую последовательность. В зависимости от способа детекции сигнала, исследуемая мутация создаёт или, наоборот, разрушает такую последовательность.
Например, ПЦР-амплифицированный геномный локус, в составе которого исследуется определённый SNP, гибридизуют с сигнальным зондом (мутация-специфичный короткий олигонуклеотид, помеченный флуорофором и гасителем с противоположных концов). Гибриды обрабатывают нуклеазой, которая расщепляет дуплексы в присутствии мутации, затем измеряется флуоресценция. Если гаситель и флуорофор локализуются близко друг к другу, флуоресценция не детектируется (в случае нерасщеплённых дуплексов), тогда как в случае расщепления дуплекса расстояние между флуорофором и гасителем становится велико и происходит усиление флуоресценции.
Чисто теоретически, метод может быть применён для скрининга любой мутации - при наличии соответствующей нуклеазы. В роли искусственных нуклеаз могут выступать белки или же рибозимы. Искусственные нуклеазы белковой природы - это химеры, состоящие по крайней мере из двух доменов, один из которых отвечает за расщепление ДНК, а другой - за связывание с соответствующим локусом. Домен, отвечающий за расщепление ДНК, может быть создан, например, на основе эндонуклеазы Fok I (226) или металл-связывающего пептида Р1, активного в присутствии ионов лантаноидов (227).
Специфичность связывания ДНК обеспечивается цинковыми пальцами структуры Cys2His2, узнающими специфичные последовательности. Для успешного разрезания ДНК, домен Fok I должен димеризоваться, в случае металл-связывающего пептида этого не требуется. Пока этот интересный подход не может быть широко применён для сканирования мутаций, но, возможно, дальнейший прогресс в белковой инженерии выведет данную технологию на новый уровень.
В отличие от предыдущей группы нуклеаз, рибозимы вполне могут быть использованы для поиска мутаций. У этих РНК-ферментов специфичность задаётся нуклеотидной последовательностью и обусловлена комплементарными взаимодействиями с субстратом. Последовательность же домена, расщепляющего ДНК или РНК, может быть консервативна. При гибридизации с исследуемой ДНК или РНК, рибозим связывается с таргетным сайтом и, в случае идеального совпадения, гидролизует фосфодиэфирную связь. Эта многообещающая техника хорошо работает в руках нескольких исследовательских групп и имеет выраженные перспективы на будущее (228).
6.3.2 Подходы, основанные на аллель-специфической ПЦР
Аллель-специфическая ПЦР (как обычная, так и ПЦР в реальном времени) основана на использовании праймера, содержащего на 3' конце основание, комплементарное мутантному нуклеотиду (Рис. 6.8) и на ингибировании реакции при использовании матрицы дикого типа из-за неспаренного нуклеотида на 3' конце. Для того, чтобы повысить специфичность распознавания мутаций, можно допольнительно вводить искусственные замены на 3'-конец праймера, что приведёт к большему количеству неспаренных нуклеотиодов при отжиге праймера на матрицу (229). Эффективное образование продукта ПЦР свидетельствует о присутствии мутантного аллеля в образце. Хотя обычно используется Taq полимераза, в некоторых случаях дискриминация мутаций лучше осуществляется другими ферментами (230). В случае, когда фермент обладает 3' > 5' экзонуклеазной "proofreading" активностью, праймеры должны быть модифицировны на 3' конце (например, фосфотионатом), чтобы блокировать отщепление критически важного для детекции мутации 3' концевого основания.
Рисунок 6.8. Схема аллель-специфической ПЦР. Праймер для ПЦР содержит на 3' конце основание, комплементарное исследуемой мутации или варианту SNP.
Для проведения стандартного анализа достаточно 10 нг матрицы, и разница в появлении продукта в случае наличия и отсутствия мутации может достигать 20 циклов (231). Метод используется очень часто, как для анализа SNP, так и для детекции определённых бактериальных или вирусных штаммов в образцах (232);(232).
Модификация этого метода, названная аллель-специфичная competitive blocker-polymerase chain reaction (ACB-ПЦР) использует специальный блокирующий «праймер» для уменьшения фонового сигнала, получаемого с матрицы дикого типа.
Неспособный к удлинению блокирующий «праймер» предпочтительно отжигается на последовательность дикого типа и тем самым предотвращает посадку туда праймера, специфичного к мутантному аллелю. Специфичность дискриминации мутаций можно дополнительно повысить при использовании белка SSB, связывающегося с одноцепочечной ДНК, а также Stoffel фрагмента Taq полимеразы. (229).
В другом варианте метода, названном LigAmp, два олигонуклеотида гибридизуются по соседству на ДНК матрице. Один олигонуклеотид спаривается с целевой последовательностью и содержит последовательность адаптора для дальнейшей ПЦР амплификации. Если целевая последовательность (например, мутантный аллель) присутствует в смеси, оба олигонуклеотида лигируются вместе и отслеживаются методом ПЦР в реальном времени (217).
Все эти подходы хорошо работают для количественного, но не качественного анализа SNP, поскольку заранее нацелены именно на детекцию определённого мутантного аллеля и не могут находить новые мутации. Кроме того, прямым ПЦР анализом можно отслеживать относительно длинные (более 15 пар оснований) делеции или инсерции в ДНК. Для этого используют праймеры, фланкирующие участок возможной мутации, и более длинные, чем в случае дикого типа, продукты ПЦР, свидетельствуют об инсерции, тогда как более короткие - о делеции. При помощи различных флуоресцентных меток, все вышеописанные подходы можно перевести на «мультиплексный» уровень (233).
6.3.3 Другие энзиматические подходы для сканирования мутаций
Для анализа мутаций можно использовать не тольно нуклеазы, но и белки, специфично связывающие неспаренные нуклеотиды. Например, белок MutS системы репарации узнаёт неспаренные нуклеотиды в дуплексной ДНК. Иммобилизованный белок может избирательно связывать на колонке ДНК-гетеродуплексы, при этом не задерживая все типы гомодуплексов. В модельных экспериментах, немеченые и флуоресцентно меченные олигонуклеотиды, либо полностью комплементарные друг другу, либо же содержащие однонуклеотидные замены, формировали дуплексы, которые затем инкубировали с MutS. При разрешении смеси на капиллярном ДНК секвенаторе, получили 29-кратное обогащение для олигонуклеотидов с однонуклеотидными делециями, тогда как обогащение в случае однонуклеотидных замен составляло всего 2 раза (234).
Также на основе белка MutS был разработан чип для быстрого скрининга SNP. Специфическое связывание меченного MutS с иммобилизованной ДНК, или меченной ДНК с иммобилизованным MutS детектируют с помощью флуоресцентного сигнала (235, 236). Измеряя расстояние от участка посадки MutS до концов ДНК, можно картировать сайт мутации. Для этих целей можно использовать физические методы quartz crystal microbalance (QCM) (237) и surface plasmon resonance (SPR).
Ещё одним белком, связывающим неспаренные нуклеотиды, является дефектная форма эндонуклеазы VII, которая может лишь связываться с неспаренными участками, но не обладает нуклеазной активностью (204). Этот белок можно иммобилизовать на твёрдый носитель (например, сефарозу), и проводить несколько раундов обогащения гетеродуплексной ДНК (238). В модельных экспериментах, содержание гетеродуплексной ДНК повысилось от ~10 до 45% после третьего раунда и более не повышалось. Метод позволяет идентификацию ранее неизвестных мутаций, но является слабо чувствительным (содержание гетеродуплексов в исходной смеси должно быть более 10%) (238).
Техника, названная “Гликозилазная детекция полиморфизмов” основана на действии специфических гликозилаз для детекции неспаренных нуклеотидов (239, 240). Для этого, целевой локус амплифицируют в ходе ПЦР с тремя нормальными dNTP и с четвёртым - модифицированным (например, dUTP) таким образом, что при встраивании эти основания становились субстратами особой ДНК-гликозилазы. Праймеры дизайнируют таким образом, что позиция первого модифицированного нуклеотида (например, урацил) должна варьировать в зависимости от того, присутствует ли мутация или нет. Последующее гликозилазное отщепление остатков урацила и химическое либо энзиматическое расщепление апиримидиновых сайтов позволяет детектировать мутацию как полиморфизм длины фрагментов. Техника была достаточно чувствительна и эффективна, но начиная с момента создания в 1998 г. использовалась лишь в одной лаборатории (241).
Последняя техника в этом разделе основана на детекции точечных замен высокоточной ДНК лигазой (242). Её протокол включает три основные стадии (Рис. 6.9). Сначала происходит гибридизация исследуемой пре-амплифицированной цепи ДНК (дикого типа или мутантной) с двумя нуклеотидными зондами, меченными наночастицами золота. При этом образуется протяжённый агрегат ДНК и золотых наночастиц, меняющий цвет раствора с красного на пурпурный. На следующей стадии добавляется высокоточная лигаза (Tth ДНК лигаза в данном примере), которая ковалентно связывает между собой только совершенные дуплексы, а в случае неспаренных нуклеотидов на концах лигирования не происходит. Затем смесь нагревают для денатурации гибридов. Если лигирования не произошло, цвет снова становится красным (исчезает высокомолекулярный агрегат наночастиц золота), а если лигирование прошло успешно, цвет остаётся пурпурным. Метод применялся для анализа однонуклеотидных мутаций в протоонкогене человека K-ras (242).
Рисунок 6.9. Детекция точечных мутаций при помощи высокоточной ДНК лигазы и двух мутация-специфичный ДНК зондов, конъюгированных с наночастицами золота. В присутствии целевой мутации, оба зонда образуют совершенные дуплексы с исследуемой ДНК, и лигаза ковалентно сшивает оба (в реальности - больше) меченных зонда. После тепловой денатурации цвет ковалентно связанных агрегатов наночастиц остаётся пурпурным, в отличие от красного для несвязанных частиц (см. текст).