Диссертация: Полногеномные подходы к функциональному анализу повторяющихся элементов

Принимая во внимание изложенные выше особенности химер, более вероятным способом их образования представляется рекомбинация между РНК L1 и U6 с последующей интеграцией рекомбинантов. Такая рекомбинация могла бы произойти при смене матрицы с одной РНК на другую в ходе обратной транскрипции (см. Рис. 1.4.6), как это показано для рекомбинации генома ретровирусов. Критическую роль в этом механизме может играть белок p40, кодируемый ORF1 ретроэлементов L1. Для этого белка известна способность формировать рибонуклеопротеидные комплексы с РНК L1 и неспецифически связывать РНК и одноцепочечную ДНК. Белок может образовать комплекс между РНК U6, белками интеграционного комплекса и мРНК L1.

(Специфическое связывание р40 с определёнными последовательностями РНК также не следует исключать (281)). Такой вид рекомбинации мог играть важную роль в формировании генома путём комбинирования различных РНК с L1 с последующей интеграцией химерных продуктов в геном.

Образование химер происходило вплоть до самого недавнего времени в эволюционной истории человека, поскольку некоторые интеграции U6-L1 уникальны для генома человека. Кроме того, по крайней мере одна интеграция химеры U6-L1 является полиморфной в человеческой популяции (Рис. 1.4.7).

Рисунок 1.4.7. Инсерционный полиморфизм химерного ретроэлемента U6-L1.

Другие химерные семейства ретроэлементов. Для того, чтобы понять, является ли случай U6-L1 уникальным примером проходящей in vivo рекомбинации транскриптов с последующей интеграцией в геномную ДНК, мы провели анализ геномных баз данных с целью поиска новых химер, образованных фрагментами других псевдогенов. Для этого в геноме человека были идентифицированы 735 псевдогенов наиболее часто встречающихся типов (50), дивергировавшие от своих консенсусных последовательностей от 0 до 10%, и для них был проведён детальный структурный анализ.

Было установлено, что химерные ретротранскрипты, напоминающие U6-L1, могут образовываться и из других транскрибируемых компонентов генома (см. Табл. 1.4.2). Приведённые данные свидетельствуют, что геном человека содержит множество интеграций продуктов РНК-РНК рекомбинации разнообразных клеточных транскриптов. Найденное явление может являться ранее не известным важным механизмом образования новых генов путём комбинирования фрагментов уже существующих экспрессирующихся последовательностей.

Таблица 1.4.2. Результаты поиска химерных ретроэлементов среди наиболее распространённых в геноме человека семейств псевдогенов.

Затем поиск химерных ретроэлементов провели для всех остальных опубликованных геномных последовательностей. При этом двухчастные структуры, аналогичные вышеописанным (Рис. 1.4.8), обнаружили во всех геномах млекопитающих, а также в геноме одного паразитического нитчатого гриба: в сумме в ДНК человека, мыши, крысы и гриба Magnaporthe grisea нашли 82, 116, 66 и 31 химеру, соответственно (Табл. 1.4.3). Химеры состоят из ДНК копий клеточных транскриптов, либо непосредственно объединённых друг с другом, либо, чаще, объединённых с 3'-концевой частью ретроэлементов, относящихся к LINE (например, L1). Клеточные транскрипты, соответствующие химерам, относятся к мРНК белок-кодирующих генов, рибосомным РНК, малым ядерным РНК, а также 7SL RNA (Табл. 1.4.3).

Таблица 1.4.3. Сопоставление 5'- и 3'-концевых частей химерных ретроэлементов млекопитающих с известными последовательностями РНК.

U5

1 (1%)

0

0

мяРНК, сплайсинг

Ядрышко, ядро

U3

8 (10%)

2 (2%)

1 (1%)

мяРНК, процессинг рРНК

Ядрышко

5S рРНК

3 (4%)

3 (3%)

4 (6%)

Рибосомная РНК

Ядрышко, цитоплазма

7 SL

1 (1%)

0

0

SRP, сортинг белков

Ядрышко, цитоплазма

Alu

2 (2%)

0

0

Эгоистичная РНК

Ядрышко, ядро, цитоплазма

3' terminal parts

L1

65 (80%)

103 (88%)

54 (82%)

Эгоистичная мРНК

Цитоплазма, ядро

мРНК

9 (11%)

9 (8%)

5 (8%)

мРНК генов

Цитоплазма

Alu

7 (9%)

0

0

Эгоистичная РНК

Цитоплазма, ядро, ядрышко

B1_Mm

0

2 (2%)

0

Эгоистичная РНК

Цитоплазма, ядро

B2_Mm1

0

1 (1%)

0

Эгоистичная РНК

Цитоплазма, ядро

B2_Mm2

0

1 (1%)

1 (1%)

Эгоистичная РНК

Цитоплазма, ядро

ID_Rn

0

0

5 (8%)

Эгоистичная РНК

Цитоплазма, ядро

4,5S РНК

0

0

1 (1%)

Рибосомная РНК

Цитоплазма, ядро

aНазвания клеточных транскриптов, соответствующих данной части химеры. Компоненты химер из генома гриба M. grisea не указаны, поскольку функция и локализация РНК WEIRD остаются неизвестными.

bКоличество и доля последовательностей данного типа среди химер.

cФункция соответствующих РНК в клетке.

Для химер характерны следующие общие свойства: (1) их 5'-концевые части являются полноразмерными копиями клеточных РНК; (2) 3'-части химер - это 5'-укороченные копии соответствующих РНК (в основном LINE); (3) обе части объединены в одной и той же ориентации относительно направления транскрипции; (4) химеры несут поли (A) хвост или А-богатый микросателлит на 3' конце, (5) химеры фланкированы короткими прямыми повторами геномной ДНК пре-интеграционного сайта.

Последняя особенность подчёркивает, что эти элементы внедрялись в геном уже в виде двухчастных ДНК-копий. Все химеры млекопитающих несли выше 5' конца гексануклеотид T2A4 или его варианты (253, 282, 283), что соответствует уже упомянутой выше последовательности T2A4 , узнаваемой LINE-элементами для инициации обратной транскрипции (278). Одновременность интеграций обеих частей химер была затем подтверждена в ходе экспериментов, основанных на исследовании эволюционного инсерционного полиморфизма (ПЦР тест-система, аналогичная приведённой на Рис. 1.4.7) (253, 283).

Рисунок 1.4.8. Схема двухчастных химерных ретроэлементов, найденных в геномах эукариот. Вставки в геномах млекопитающих расположены ниже мотива TTAAAA. Вставки в геномах млекопитающих и гриба содержат поли (А) последовательность или А-богатый микросателлит и фланкированы прямыми повторами геномной ДНК длиной 10-25 пар нуклеотидов.

Количество химер в геномах мыши и крысы, по-видимому, недооценено, поскольку их 3'-концевые части иногда прерваны брешами в сборке геномных ДНК и отсутствуют в опубликованной геномной последовательности (23 и 33 случая, соответственно). Важно отметить, что создающий химеры механизм часто объединяет функциональные копии клеточных транскриптов, часто не имеющих ничего общего с мобильными элементами. Многие химеры можно рассматривать как новые гены, поскольку они транскрибируются, причём некоторые из них - тканеспецифически (253, 282, 284, 285).

По-видимому, все химерные ретроэлементы были созданы по механизму, аналогичному приведённому ранее на Рис.1.4.6. Хотя основной энзиматической активностью Обратной транскриптазы (ОТ) является синтез кДНК на неизменной матрице РНК, ОТ также способна к смене матриц в ходе обратной транскрипции. Например, известно, что «прыжки» ОТ ретровирусов с одного сайта матричной РНК на другой необходимы для образования LTR. Кроме того, поскольку ретровирусные частицы обычно содержат две молекулы матричной РНК (286), то высокая частота актов смены матрицы значительно увеличивает изменчивость ретровирусов путём рекомбинации между этими РНК (287). Именно эта рекомбинация, скорее всего, отвечает за мозаичные структуры большинства ретровирусов (288, 289).

Помимо образования химерных ретрогенов, смена матриц при обратной транскрипции LINE могла сформировать некоторые химерные SINE-элементы (290), а также мозаичные структуры L1 элементов грызунов, скорее всего, образовавшиеся при РНК рекомбинации между разными мРНК L1 (291). Эволюция некоторых семейств LINE могла включать РНК-РНК рекомбинацию, приводившую к объединению 3'-концевой части LINE с новой последовательностью на 5'-конце. Это подтверждается тем, что 5'-нетранслируемые участки семейств L1 человека, мыши и крысы, негомологичны друг другу (292). Интересно, что для ОТ, кодируемой другим членом суперсемейства LINE - R2 из геномов членистоногих, in vitro были описаны «прыжки» с одной матрицы на другую, при этом образовывались химеры R2-R2 (293).

Эта модель образования химер была позднее поддержана экспериментальными данными по ретротранспозиции L1 LINE элементов человека in vitro (294). Авторы охарактеризовали 100 событий ретротранспозиции de novo в клетках HeLa. Важно, что одна вставка (1%) представляла собой только что образованную химеру, состоящую из полноразмерной U6 мяРНК, объединённой с 5'-укороченным L1. Похожие результаты получили и in vivo на модели ретротранспозиции L1 в трансгенных мышах. 13% из 33 новых ретротранспозиций, по-видимому, являлись результатом смены матрицы в ходе обратной транскрипции (295). В этой связи интересно, что недавно была предложена гипотеза, согласно которой прыжки ОТ с РНК LINE на геномную ДНК могут повышать эффективность интеграции и, таким образом, могут быть востребованы в норме для успешного прохождения ретротранспозиции LINE (293, 295).

Вцелом, все эти данные анализа геномов, эволюционных исследований, а также экспериментальные доказательства, убедительно свидетельствуют, что смена РНК-матриц может проходить в ходе обратной транскрипции LINE. Нам удалось найти соответствующие химеры во всех геномах млекопитающих, но не в ДНК амфибий, рыб и беспозвоночных. Однако же, химерные элементы были найдены в геноме гриба-паразита риса Magnaporthe grisea (296), что говорит о консервативности этого механизма среди представителей царств животных и грибов.